从事微生物检测你不得不了解的那些事儿（包含生物安全柜的使用维护注意事项等）！
导
语
我们所说的微生物学实验室是生物学领域的一个基本实验室。那么我们对于一个完备的微生物学实验室，我们都有哪些注意事项呢?
一、微生物实验室基本配置都有哪些要求？
常用仪器设备
(1)超净工作台：微生物的培养都是在特定培养基中进行无菌培养，那么无菌培养必然需要超净工作台提供一个无菌的工作环境。超净工作台的主要用途是微生物的接种及处理时的无菌操作。
(2)无菌室（接种室）或接种箱
要培养微生物，首先就需要接种，而接种必须在无菌条件下进行。这就需要建造无菌室或接种箱，为接种创造必要的条件。
无菌室可以建在实验室内，作为实验室的一个小套间。面积为4～5平方米，高2.5米左右。无菌室外应连接一个小缓冲间，面积为2平方米左右。缓冲间和无菌室的门不要建在同一条直线上，以减少空气中杂菌进入无菌室。
无菌室和缓冲间应作到清洁、密闭性好，室内最好有换气设备，以便在工作结束后更换室内空气。两个房间中应各安装1盏30瓦紫外线灯管和照明用的日光灯，无菌室的紫外线灯应悬吊在工作台的正上方，距台面1米，以发挥最大的消毒功能。无菌室内的工作台等用具用品，应经常保持清洁，避免杂菌污染。
如果没有条件建造无菌室，可以用木制的接种箱代替。接种箱结构简单，容易制作，其正面安装玻璃，便于观察。箱前方开两个圆洞各接连1只套袖，操作时将两臂从套袖伸入箱内进行操作。箱内也应悬吊一盏紫外线杀菌灯和一盏日光灯。
(3)培养箱：培养箱有很多种类型，它的用途在于为微生物提供一个适宜的生长环境。主要类型包括生化培养箱，霉菌培养箱，厌氧培养箱等。它们的区别主要在于：
a.生化培养箱只能控制温度。这类培养箱可作为一般细菌的平板培养。
b.霉菌培养箱可以控制湿度和温度。它主要用在霉菌的培养。
c.CO2培养箱适用于厌氧微生物的培养，例如，双歧杆菌。
(4)天平：它是用于精确称量各类试剂。实验室常用的是电子天平，电子天平按照精度不同又有不同的级别。
(5)微生物均质器：它的作用在于从固体样品中提取细菌。用微生物均质器制备微生物检测样本具有样品无损伤、无污染、不升温、不需要洗刷器皿，不需灭菌处理等特点，是微生物实验中使用较为方便的仪器。
(6)菌落计数器：菌落计数仪可帮助操作者计数菌落数量。通过放大、拍照、计数等方式准确获取菌落的数量。有些高性能的菌落计数器还可直接连接电脑来完成自动计数的操作，方便快捷的计数。
(7)微波炉/电炉：它主要用于溶液的快速加热，微生物固体培养基的加热熔化。
(8)高压灭菌锅：微生物学所用到的大部分实验物品、培养基、试剂都应严格通过消毒灭菌。灭菌锅也有不同的大小型号，有些是手动的，有些是全自动的。用户就要根据自己的需要选购。
(9)移液器：它是用于精密量取各类液体。常见的液体量器有量筒、微量取液器、移液管、刻度试管、烧杯等。
(10)冰箱：冰箱是实验室中保存试剂和样品必不可少的仪器。微生物学实验中用到的试剂有些要求是4度保存，有些要求是负20度保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温度下保存。具体来说，不同温度下保存的物品如下：
a.4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。
b.-20℃适用于某些试剂、药品、配好的抗生素等。
c.-80℃适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、感受态等的保存。
(11)生物安全柜：微生物实验中所涉及到的部分试剂和样品微生物有些是有毒的，对于操作人员来说伤害比较大。为了防止有害的悬浮微粒、气溶胶的扩散，可以利用生物安全柜对操作人员、样品及样品间交叉感染和环境提供安全的保护作用。
(12)摇床：摇床是实验室比较常用的一种仪器，在微生物实验操作过程中，液体培养基培养细菌时需要在特定温度下振荡使用。
(13)纯水装置：纯水装置包括纯水机和蒸馏水器。蒸馏水器的价格比较便宜，但在造水过程中需要有人值守；纯水机价格高些，但是使用方便，可以储存一定量的纯水。纯水的使用也有不同级别，实验中配制试剂，配制培养基均都需用纯水。
(14)生物显微镜：由于微生物的体积比较小，所以在观察时需要借助生物显微镜。生物显微镜主要用于微生物和微小物品结构和形态等方面的观察。
(15)冷冻干燥机：主要适用于细菌、微生物、酵母等的干燥作用。用于干燥保存易脱水的产品，在加水以后能够再次恢复原材料的特性，不影响其生物活性。通过冷冻干燥，细菌之类的材料成为干燥状态，从而不会发生化学改变。
(16)分光光度计：分光光度计在微生物试验中用于测定微生物悬液的浓度，可以正确选取合适的培养时间。一般是在600nm波长测定菌液浓度。
(17)恒温箱：用于恒温条件下培养微生物。恒温箱的调温范围一般为20～45℃之间。培养酵母菌和霉菌时，一般可调至28℃，培养细菌和放线菌时，可根据菌种的生长温度进行调温，一般为30～37℃。
(18)电烘箱（干燥箱）：用于玻璃器皿等物的烤干和灭菌。电烘箱的调温的范围一般为40～180℃，对玻璃器皿等物进行灭菌时，可将温度调至160℃，灭菌4小时，即可将器皿上的微生物全部杀死。灭菌完毕后，在电烘箱温度还没有降到50～70℃以前，不要打开电烘箱，以免器皿破裂。
(19)恒温水浴锅：水浴锅是一种控温装置，水浴控温对于样品来说比较快速且接触充分。有些微生物反应需要在37度，42度，56度下水浴进行，所以恒温水浴锅可以提供需要的温度。
(20)酸度计：用于配制试剂时精确测量pH值，从而保证配制的溶液的精确性。有时也需要利用pH计测定样品溶液的酸碱度。
(21)离心机：用于收集微生物菌体以及其他沉淀物。离心机有冷冻和常温之分。有些样品由于在常温下不太稳定，需要低温环境，要视样品的种类而定。
离心机洗要求
在离心机内腔，设置多个清洗头或清洗管，离心机可在不开盖或运转过程中对离心机内部进行清洗。重点有以下几个部位：①转鼓底面及轴承座部位的清洗；②拦液板表面及转鼓筒体外表面；③转鼓筒体内表面；④翻盖内表面及进料、刮刀等装置表面；⑤外壳内表面。
离心机维护规则
1.一次规则
当系统出了故障，你可以试探性地改变某些状态，一次可以改变一个参数。做一些简单的改变步骤，也许就能解决问题。
2.二次比较规则
在动手检修之前已经明确了故障所在，或者已经确定了解决故障的方案。换句话说，动手之前已经找对了解决办法。例如，在进样过程中发现内标物的峰值变低了，可以重复进样看看重复性如何，如果是偶然变低，是否是定量管里进了气泡。这个规则可用于考察系统改变后的情况。更换了流动向后在正式进样前可以进两次标准品以检查保留时间的稳定情况和色谱峰的稳定性。在梯度洗脱中如果出现了多余的峰，可以空载梯度洗脱一次(真的有问题吗？)，用此规则可以避免不必要的改变，尽快确定纠正措施。
3.取代规则
用好的部件换下可疑的部件，是查找故障的最好方法。如果你怀疑检测器引起了噪音，就换一个性能好的无转子硫化仪检测器。如果故障被排除了，就说明换下的检测器有问题。这个规则应用的规模有大有小，可以从换整个部件到换印刷线路板上的集成块。
4.换回规则
这个规则和取代规则一起运用，好部件取代了溶体流动速率测定仪可疑部件后情况并未得到改善，应重新换上原部件。这样做的维修费用最小，也防止了用过的部件积压下来无转子硫化仪。这条规则仅适用于单一的故障。换回原则不适用于以下的情况：
①在取下时新部件已损坏(如泵密封垫圈)；
②部件价格低(如柱内衬过滤片)；
③重新装上原部件要冒损坏的风险；
④定期更换的部件。
(21)液氮罐：液氮罐储存液氮，可用于细菌、酵母、霉菌和大型真菌等各种微生物的长期保存。
(22)接种针：用于接种和分离微生物。根据不同用途做成针状、环状、钩状、刀状和铲状等。接种针由针头和针柄两部分组成。针头由白金或铬镍合金（细电炉丝）制成，长约7厘米。针柄可用玻璃棒或铝管制成，长约20厘米。将针头烧结在针柄上即成。
(23)酒精灯：用于接种时对接种工具进行灭菌。酒精灯火焰上部热度最高，应利用这一最高温度区烧灼接种针或试管口。
(24)均质器：均质器使样品处理过程中不可缺少的设备。常用的均质器主要是旋转均质器和拍击式均质器。
旋转式均质器是靠旋转的刀片将均质杯中的样品打碎。缺点是每次均质都要更换刀片和均质杯，样品易受到污染，均质过程中容易产生热量使样品中的微生物受损。
拍击式均质器使用无菌均质袋，拍击的机械装置作用在均质袋上，不和样品直接接触，因此不会受污染。拍击式均质器由于使用方便，不易受污染，使用越来越广泛。但其缺点是均质的力量不足，对于坚硬的样品不但无法均质均匀，还会引起均质袋的破损。
使用注意事项：
1.使用前先将电源插头固定牢靠后，再打开机器开关。插头不能使其出现松动，因为机器工作时会产生振动导致插头脱落。这种突然短点对机器会造成损伤。
2.均质器工作时不准随便打开均质器门，防止样液飞溅（有的均质器打开门以后自动停止拍击均质） ，一定要先关机器再开门，然后同样关闭门之后再开机。
3.使用均质器之前，一定要检查均质器内是否有异物，防止损伤机械装置或均质袋。
4.坚硬样品，尽量不要用拍打式均质器，防止均质袋破裂，冷冻样品需缓化解冻以后才能使用拍击式均质器。当一定要拍打坚硬样品时，最好加套均质袋。
5.均质器的底部是空的，如遇均质袋意外破裂时，方便清理溢出物。
6.均质器和均质袋放置在阴凉干燥处，特别是均质袋应避酸碱、避阳光，防止其过早的变脆老化。
7.均质器用完之后，先关机断电，然后将其内外清理干净。
8.对于一些拍打均质后，容易堵塞移液管或移液器枪头的样品，建议使用带过滤网的无菌均质袋。
(25)常用玻璃器皿:
①培养皿（平皿）：用于盛放固体培养基，是培养微生物和观察微生物的主要器皿。一般直径为9厘米。可根据活动规模准备若干个。
②试管：用于盛放斜面培养基（固体），是接种微生物的主要器皿。常用的有两种。较大的长220毫米，直径20毫米；较小的长150毫米，直径15毫米。可根据需要选用其中一种并准备若干个。
③锥形瓶：用于盛放液体培养基。是用液体培养基培养微生物的主要器皿。一般容量为50、100、250、300、500、1000毫升。可根据活动需要选择和准备。
④量筒、量杯：用于定量量取各种液体。
⑤移液管（吸管）：一般容量为0.5、1、5、10毫升等，可根据需要选择和准备。
⑥其它：烧杯、漏斗等。
注意事项：
以上介绍的是微生物实验室的基本仪器配置，在组建实验室时还需要其他一些耗材，例如试管架，无菌采样及称样袋，接种环，三角瓶，量筒，脱脂棉，纱布，试管筐，玻璃试管，灭菌吸管，凉干架，剪刀，镊子，过滤器等。
二、质量控制方式及计划制定、实施
1、主要质量控制方式
1)外部质量控制：实验室之间的比对、能力验证、测量审核。
2)内部质量控制：
a)使用不同分析方法(技术)或同一型号的不同仪器对同一样品进行对比检测（方法比对、仪器比对）。
b)由两个以上人员对保留样品进行对比检测（人员比对）。
c)由同一操作人员对保留样品进行对比检测（留样再测）。
d)在日常分析检测过程中使用的标准溶液的配置（核查溶液）。
e)用标液对仪器测试过程中进行质控（添加回收）。
2、质量控制计划制定和实施
1)实验室应在每年年底建立次年的质量控制计划，以确保并证明检测过程受控以及检测结果的准确性和可靠性，质量控制计划包括能力验证、测量审核和实验室内部比对(如：人员比对、方法比对、留样再测)；计划中还应包括判定准则和出现可疑情况时应采取的措施，且覆盖申请认可或已获得认可的所有检测技术和方法。
2)技术负责人指定资深人员负责编写质量控
制计划，技术负责人对计划进行审核并负责组织监督质量控制计划的实施。
3)技术负责人对质控资料进行统计、分析，组织对上述活动的可行性和有效性评审。
4)质量监督员监督检测人员完成上级下达的样品考核任务和比对、能力验证试验，督促实施内部质量控制要求，审核比对和能力验证试验的结果。
5)检测人员：完成质控活动中应承担的检测工作，认真填写检测原始记录。
三、生物安全柜
生物安全柜放置位置和使用：
（1）在安全柜的后方和左右两侧尽可能留有30cm的空间，利于维护。
（2）在安全柜的上面应留有30～35cm的空间，以便准确测量和更换过滤器。
（3）生物安全柜应远离人员、物品流动以及可能会扰乱气流的地方。
操作者：
1.要在实验开始前将所有必要的物品置于安全柜内，以尽量减少双臂进出前面窗口的次数；
2.操作者的双臂应与由上而下的气流相垂直地缓慢进出前面的开口；
3.在手和双臂伸入到安全柜中大约一分钟后再开始正式工作；
物品得这么放：
1.在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。安全柜内放置的物品数量必须保持在最低数量。
2.放入安全柜内的物品应尽可能地放在工作台后部的边缘位置，并使其在操作中不会阻挡后部吸风槽的的正常回风功能。
3.II级生物安全柜前面的前吸风槽不能被记录本、仪器设备或其它物品阻挡。
4.保持所有材料远离玻璃悬窗至少4英寸（10cm）。
5.在操作期间，避免移动材料，避免操作者的手臂在前方开口处移动。
生物安全柜的操作和维护：
※在开始工作以前及完成工作以后，应至少让安全柜工作5分钟来完成将污染的空气（气溶胶）排出的“净化”的过程；生物安全柜的所有维修工作应该由有资格的专业人员来进行。在生物安全柜操作中出现的任何故障都应该报告，并应在再次使用之前先进行维修。
紫外线杀菌灯：
如使用紫外线杀菌灯，应每周进行表面清洁，以祛除可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。用适宜的玻璃清洗剂，对玻璃悬窗及UV灯管进行清洗。使用紫外线杀菌灯时要注意保护人员眼睛和皮肤避免因不慎暴露而造成伤害。紫外线杀菌灯应定期更换(核查紫外线照射强度,试纸或手持式检测仪)。
清洁和消毒：
在每次使用前后，要清除生物安全柜内表面的污染。工作台面和四周内壁要用消毒剂进行擦拭，所用的消毒剂要能够杀死安全柜内可能发现的任何微生物。可用75%的乙醇或适宜的消毒液，对安全柜内部和工作面进行表面消毒(不可使用含卤素的消毒剂清洁表面)。
在生物安全柜内的实验操作结束后，包括仪器设备在内的所有物品都应清除表面污染，并移出生物安全柜。
灭菌处理：
生物安全柜移动、变换用途、更换过滤器之前等，必须用灭菌的方法清除污染；
最常用的方法之一是用甲醛蒸汽熏蒸，这些工作应该由有资格的专业人员来操作，这样才能正确有效地清除生物安全柜的污染，先进的消毒方法可使用二氧化氯制剂或过氧化氢蒸汽消毒机。
生物安全柜生物安全性能评价：
检测项目应包括：
现场检测的项目应至少包括垂直气流平均速度、气流模式、工作窗口气流平均速度、送风高效过滤器检漏、排风高效过滤器检漏、柜体内外的压差（适用于Ⅲ级生物安全柜）、工作区洁净度、工作区气密性（适用于Ⅲ级生物安全柜）。过滤器检漏是重要安全指标！
生物安全柜的检验：
定期请有资质的专业机构进行“检漏”，推荐为1年1次，索要证书及原始检测数据。
不合格应马上更换HEPA滤膜（高效过滤器应由有资质的专业人员进行更换，更换前应进行原位消毒，确认合格后，按标准操作流程进行更换。新换高效过滤器，应进行检漏，确认合格后方可使用。）
对可能影响检测和校准结果的设施和环境条件的技术要求加以文件化，建立洁净室运行和监控作业指导书。
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