胞外RNA是什么？胞外RNA详细介绍
人类仍然被笼罩在新冠肺炎的阴影之下，没有人能够告诉我们将口罩脱下的明确日子，难以呼吸的困境，让我们对生命和非生命形式的物质进行探索的视野逐渐扩大，新冠疫苗的研发在病毒变异的追赶下面临着极大的挑战，而旧药使用和新药研发也并不轻松，中草药（其中包含有效的miRNA成分）的重要性在此次疫情爆发的过程中逐渐被广泛接受，中西药结合使用来应对突发病毒的感染或许是一种更好的方式。此时胞外RNA（extracellular RNA, exRNA）应对疾病的研究被重新提上了日程。在此，我们从胞外miRNA跨界转移的角度着手讲述一下exRNA是如何实现跨物种“裸奔”的。
01 胞外miRNA是实现细胞间交流的新方式
我们知道，RNA很长一段时间被认为仅存在于细胞内，后来发现，其实RNA在胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）的保护下遍布于全身，因此exRNA的出现并非偶然。南京大学生科院院长张辰宇教授团队一直致力于该方向的探究，其对胞外miRNA如何从细胞中释放、又是如何被检测、怎样在疾病治疗中发挥功能等一系列研究结果证明了miRNA在机体中的存在具有重要的临床价值。
细胞间交流方式以及miRNA介导的基因调控网络
（Xi Chen et al. 2011）
miRNA是一类由19至24个核苷酸组成的内源性非编码RNA，调节真核生物中蛋白质编码基因的转录后沉默，而机体无细胞循环中的miRNA在不同疾病中的存在有着很大的差异。目前认为胞外miRNA来源于以下三种途径：
①由组织损伤、慢性炎症、细胞凋亡/坏死或细胞半衰期短而从破碎的细胞中被动分泌，如血小板；
②通过微囊泡的主动分泌，包括外泌体和脱落的囊泡，在正常和病理条件下几乎所有的细胞都会释放膜包裹的细胞碎片；
③与RNA结合蛋白结合，从供体细胞释放。
细胞与邻近细胞之间的交流和感知局部微环境的能力构成了多细胞生物机体协调细胞活动的基础，细胞连接、黏附和可溶性信使的作用构成了细胞间交流的几种主要方式。随后的研究表明，胞间miRNA的水平转移也是实现细胞间交流的重要方式，但对于转移机制的研究目前还不是特别清楚。
被动分泌的miRNA和主动分泌miRNA
（Xi Chen et al. 2011）
尽管核糖核酸酶（RNase）无处不在，循环中的miRNA依然能够稳定的存在，其原因是什么呢？张辰宇团队提出了两种机制来解释：（i）通过囊泡膜来保护分泌的miRNA不被降解；（ii）通过与RNA结合蛋白（例如AGO2和NPM1）结合而稳定存在。
02 胞外miRNA进入外泌体的方式
对miRNA进行包装并非是随机发生的，而是特定类型的miRNA可能会被优先分配到微泡中。有研究发现，血液细胞和单核淋巴瘤细胞THP1能够主动地、选择性地将miRNA包装到微泡中，响应各种不同的刺激将其分泌到机体循环中。神经酰胺依赖性分泌机制可以诱导核内体转移至胞外多囊泡体（MVBs）中，同时有研究发现这种方式可以积极调节HEK293细胞中外泌体miRNA的释放，也就是说，控制神经酰胺生物合成的中性鞘磷脂酶2（nSMase2）可以调节外泌体miRNA的分泌，由nSMase2介导的miRNA分泌的增加可能与细胞释放的外泌体数量增加或包装到外泌体中的miRNA数量增加有关。miRNA进入外泌体的装载也可能由RNA诱导的沉默复合物（RISC）的特定蛋白质控制。通过与AGO2结合，miRNA功能所需的GW182在外泌体中大量富集。与此研究结果类似的是，在THP-1细胞的外泌体中观察到了AGO2蛋白的大量存在。这些发现表明，外泌体不仅转移miRNA，而且还传递RISC的细胞成分以增强miRNA的功能。有人提出了分泌miRNA的生物发生，分类和释放的多种机制，发现将特定的miRNA大量的包装到微泡中似乎是一个选择性过程。由于已在外泌体中检测到RISC的成分（如AGO2和GW182），因此RISC可能参与了将miRNA包装到外泌体中的过程。值得注意的是，神经酰胺依赖性途径控制miRNA渗入外泌体，但抑制miRNA包装入HDL颗粒。因此，nSMase2可能是决定miRNA渗入到外泌体或RNA结合蛋白的关键因素。揭示miRNA如何包装到外泌体、脱落的囊泡和HDL颗粒，以及在此过程中是否存在调节的特异性还需要进一步探究。
03 受体细胞摄取miRNA
多项研究表明，包装于微泡中的分泌型miRNA可以传递到受体细胞中充当功能性分子，通过与内源性miRNA相似的机制调控基因的功能。例如来源于THP-1细胞的含有大量miR-150的微泡可将miR-150递送至人微血管内皮细胞（HMEC-1），从而抑制受体细胞中c-Myb（miR-150的已知靶基因）的表达，同时增强细胞迁移能力。还比如分泌型的miR-146a可抑制其已知靶基因ROCK1在其受体前列腺癌PC-3 M细胞中的表达。此外，向植入前列腺癌PC-3 M细胞的裸鼠瘤内注射富含miR-16的外泌体会导致分泌型的miR-16转移到癌细胞中，并抑制含3'非翻译区的萤光素酶报告分子BCL2（miR-16的直接靶标）的表达。
miRNA的分泌和释放示意图
（Xi Chen et al. 2011）
04 胞外miRNA介导物种间的协同进化
这里得从一项有趣的研究说起，2017年张辰宇团队在PLOS Genetics上发表文献证明miRNA可以实现在物种间的相互“交流”，该研究提出一种有趣的说法，即“We are what we eat——我们吃的是什么，我们就会成为什么”，研究基于人类每天的进食情况，获得了来自水稻（Oryza sativa）和十字花科（Brassicaceae Burnett）中两种最高浓度的植物miRNA，即MIR156a和MIR168a，而研究发现，MIR168a可以与低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）miRNA结合，抑制LDLRAP1在小鼠肝脏中的表达，从而调节低密度脂蛋白从血浆中的清除。这项实验为miRNA 跨物种转移提供了可能的模型。我们不仅是在吃食物，从一定程度上来讲，我们吃的是“信号”和“信息”。miRNA跨物种调控作用，很可能是一种保守的普遍现象，且可以通过摄入植物性miRNA来预防和控制肿瘤、慢性炎症、肺纤维化和心血管等疾病。
饮食影响蜜蜂幼虫的发育方式
(Chao Yan et al. 2020)
从进化的角度来看，跨物种miRNA转移能够实现物种之间的交流和信号传播。虫媒植物是经过昆虫授粉的，并且含有miRNA，它们会影响花朵的大小、形态、颜色和发育，并产生对包括蜜蜂在内的昆虫有吸引力的花粉。用花粉喂食的蜜蜂幼虫发育成工蜂，因为它们比仅食用蜂王浆的幼虫食用更多的植物miRNA，而食用蜂王浆的蜜蜂幼虫则发育成蜂王。这项有趣研究提出了蜜蜂成虫发育形成的机制，以及胞外miRNA成为跨界调控系统的一种可能。这是否是从另一物种“借”RNA来调节自身生存和适应过程的一种普遍现象呢？由于物种经历了数百万年的共同进化以形成我们今天生活的生态系统，因此跨界miRNA转移在自然界中或许是普遍存在的。
单核细胞分泌miR-150可以增强内皮细胞的迁移，调节受体细胞中基因的表达；与癌症关联的血清miRNA图谱，显著提高了癌症早期诊断的准确性；一系列的研究结果表明，胞外miRNA对疾病的诊断和调控具有重要的临床意义。回到中草药对病毒性疾病的治疗研究中，2015年张辰宇研究团队发现，金银花编码的MIR2911可以直接靶向甲型流感病毒，同时，利用生物信息学预测和荧光素酶报告系统分析表明，MIR2911可以靶向多种IAV，包括H1N1、H5N1和H7N9，合成的MIR2911显著抑制了H1N1编码的PB2和NS1蛋白的表达。该研究表明，MIR2911是中药中第一个直接靶向各种IAV的活性成分，可能代表了一种新型的天然产物，有效抑制病毒感染。
新冠疫情对公众健康造成了巨大威胁。病毒的快速突变，意味着开发有效的疫苗可能会面临时间上的巨大挑战，而开发广谱抗病毒药物或许是应对疾病爆发更好的一种方式。富含MIR2911和MIR2911的金银花汤可能会成为抑制病毒感染的治疗策略。除了针对各种亚型的IAV，研究还表明，金银花来源的MIR2911可以通过靶向病毒基因，直接抑制水痘带状疱疹病毒（病原体在初次感染时引起水痘，在重新激活时引起带状疱疹）和肠病毒（儿童手足口病的主要病原体）的复制。以上研究表明，不同来源的miRNA可实现跨物种之间的信息传递，并调控靶细胞中基因的功能，为人类慢性疾病的治疗提供了新方向。同时，胞外或植物性miRNA还能够通过与入侵病毒相应的互作模式来抑制病毒的复制，对病毒性感染疾病的治疗提供了新的途径。
参考文献：
1. Xi Chen, Hongwei Liang, Junfeng Zhang, Ke Zen and Chen-Yu Zhang. Secreted microRNAs：a new form of intercellular communication. Cell. 2011.
2. Kegan Zhu, Minghui Liu, Zheng Fu et al. Plant microRNAs in larval food regulate honeybee caste development. PLOS Genetics. 2017.
3. Zhen Zhou, Xihan Li, Jinxiong Liu et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses. Cell research. 2015.
4. Chao Yan, Xi Chen, Chen-Yu Zhang. Nanjing School: Extracellular microRNA mediates co-evolution between species. Nature. 2020.
5. Xi Chen, Yi Ba, Lijia Ma , Xing Cai et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 2008.
6. Yujing Zhang, Danqing Liu, Xi Chen et al. Secreted Monocytic miR-150 Enhances Targeted Endothelial Cell Migration. Molecular cell. 2010.
7. Yuan Yin, Xing Cai, Xi Chen et al. Tumor-secreted miR-214 induces regulatory T cells: a major link between immune evasion and tumor growth. Cell research. 2014.
8. Patrick S. Mitchell, Rachael K. Parkin, Evan M. Kroh et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. PNAS. 2008.