设计细菌特异性16S引物对植物内生细菌组进行测序和定量分析

Designing specific bacterial 16S primers to sequence and quantitate plant endo-bacteriome

SCIENCE CHINA Life Sciences [IF 6.038]

DOI：https://doi.org/10.1007/s11427-021-1953-5

发表日期：2021-07-22

第一作者：Liying Chen (陈丽莹)^1,2,Mengting Zhang (张梦婷)²

通讯作者：Lili Zhang (张莉莉)(zhangll@im.ac.cn)² and Rongxiang Fang (方荣祥)(fangrx@im.ac.cn)^2,4

合作作者：Da Liu, Hongbo Sun, Jianxiang Wu, Yan Huo, Xiaoying Chen

主要单位：

¹浙江大学农业与生物技术学院 (State Key Laboratory of Rice Biology, Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

²中国科学院微生物研究所(State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

⁴国家植物基因研究中心(National Plant Gene Research Center, Beijing 100101, China)

摘要

植物内生细菌定殖在植物组织内部，与植物互作关系紧密。过去二十年来，16S扩增子二代测序技术(16S-seq)广泛应用于细菌群落的研究。由于植物细胞器DNA与细菌16S rDNA具有高度的序列同源性，16S-seq应用于植物内生细菌组测序解析时，扩增子文库中会产生大量植物源DNA污染。本研究中，我们设计了细菌16S rDNA的特异性引物对，包括799F/1107R, 322F/796R和322F-Dr/796Rs (引物322F的次末位碱基突变)。这些引物对能够从植物组织总DNA中特异性扩增细菌的16S rDNAs。通过数据库在线分析和实验分析，我们评估了这些引物对的特异性和细菌覆盖度。实验结果表明，这些引物对即便应用于内生菌含量非常低的组织时，其扩增子文库中植物源DNA序列占比也不超过5%。将引物对322F-A/796R应用于荧光定量PCR (qPCR)检测水稻不同组织的内生菌含量，通过设计核酸水平的绝对定量分析方法，我们揭示了水稻叶、根内生菌群的丰度分别为10⁶–10⁷ g^-1 (FW)、10⁹–10¹⁰ g^-1 (FW)。我们开发的这套方法实现了植物内生细菌组的无污染16S-seq，操作简便，经济实惠，并且实现了植物内生细菌组核酸水平的定量分析，将极大地促进植物微生物组相关研究。

背景

细菌的16S rDNA全长1.5 kb，包含9个序列可变区和10个序列保守区，可变区与保守区交替排列。受二代测序读长的限制，16S-seq应用于细菌群落测序解析通常扩增16S rDNA的1-3个可变区。植物的线粒体18S rDNA (Mt18S)、叶绿体16S rDNA (Ct16S)与细菌的16S rDNA在全长上表现出70%以上的序列同源性，保守区具有更高的序列同源性。因此，16S-seq应用于植物内生细菌组测序解析时，扩增子文库中会产生大量植物源DNA (Mt18S和Ct16S)污染，严重干扰后续的菌群数据分析。

引物对799F/1193R已广泛应用于多种植物的菌群测定。由于799F能够避开对植物叶绿体16S rDNA的扩增，而多数植物线粒体18S rDNA的该引物对扩增产物比细菌16S rDNA的该引物对扩增产物长大约350 bp，因此，该引物对扩增产物中的细菌产物和线粒体产物能够通过琼脂糖凝胶电泳分离开，从而纯化获得细菌的扩增子产物。然而，水稻线粒体18S rDNA的该引物对扩增产物仅比细菌的长约50 bp，琼脂糖凝胶电泳分离纯化难度较大。针对16S-seq解析植物内生细菌组所面临的宿主污染问题，我们设计了能够在扩增过程中高效规避植物源DNA序列的引物对。实验结果表明，所设计的引物对具有良好的细菌覆盖度，可以应用于包括水稻在内的多种植物的内生细菌组无污染测序解析，而且可以应用于植物内生细菌组的qPCR定量分析。

结果

设计细菌16S rDNA特异性引物对

Primer design for plant DNA-free amplification of bacterial 16S

根据多种植物的Mt18S、Ct16S与多种细菌16S rDNA的序列比对结果及引物设计原则，我们设计了2个理论上能够避开植物Mt18S的引物322F和1107R、1个能够避开植物Ct6S的引物796R (图1A)。结合引物799F和Illumina二代测序平台读长的限制，我们将四个引物组合得到两对理论上能够同时避开植物Mt18S和Ct16S的引物对 (图1B)。

图 1 细菌16S无植物DNA扩增的引物设计

Primer design for plant DNA-free amplification of bacterial 16S

(A) 细菌16S引物的位置、序列及名称，四个引物，包括 799F
和三个新设计的引物，在 3’ 端与植物 Mt18S 或 Ct16S 均不匹配。仅显示水稻 Mt18S 或 Ct16S 序列；
其他植物在比对区域内具有相似的序列。箭头所指为引物与植物Mt18S或Ct6S的错配位点，红色箭头指示引物3’末端与植物Mt18S或Ct6S的错配位点。H=A/T/C，V=G/A/C，W=A/T，R=A/G，M=A/C，K=G/T，Y=C/T。除引物799F外，其他正向（322F）和反向（796R和1107R）引物均根据大肠杆菌DSM 30083（GenBank登录号：JMST01000030）16S中第一个和最后一个核苷酸的位置命名。

(B) 细菌16S特异性引物对及扩增区域。(a) 广泛使用的引物组。(b) 引物对 322F/796R 旨在放大细菌 16S V3-V4 区域，同时避免植物 Mt18S（322F，无 mtDNA）和 Ct16S（796R，无 ctDNA）。(c) 引物对 799F/1107R 旨在放大细菌 16S V5-V6 区域，同时避免植物 Mt18S（1107R，无 mtDNA）和 Ct16S（799F，无 ctDNA）。

评估引物及引物对的覆盖度

Evaluation of the designed primer pairs

首先，使用SILVA数据库在线分析引物及引物对的细菌覆盖度。338F/806R (V3–V4)和799F/1193R (V5–V7)是广泛应用的16S引物对。因此，以这两对引物为参照，我们在SILVA SSU r132数据库中评估了所设计引物和引物对的覆盖度(表1、2)。分析结果表明，当有一个碱基(非3’末端碱基)错配时，338F/806R的细菌覆盖度为92.5%，322F/796R的细菌覆盖度为82.4%，799F/1193R和799F/1107R的细菌覆盖度不足80%，分别为77.9%、71.9% (表2)。322F/796R的细菌覆盖度高于植物细菌组16S-seq广泛使用的引物对799F/1193R，799F/1107R的细菌覆盖度与799F/1193R相近。

表 1 本研究中所有引物的覆盖度

H=A/T/C, V=G/A/C, W=A/T, R=A/G, M=A/C, K=G/T。

表 2 本研究中所有引物对的覆盖度

其次，我们以稻田土壤DNA为样本，实验评估了所设计引物对的细菌覆盖度。以338F/806R和799F/1193R这两对引物为参照，比较分析了所设计引物对322F/796R和799F/1107R的土壤菌群覆盖度。分析结果表明，本研究所设计的细菌16S特异性引物对322F/796R和799F/1107R对土壤菌群的解析能力与已广泛应用的引物对338F/806R和799F/1193R相似；并且，相同16S可变区段的引物对对菌群的解析具有更高的可比性。

图 2 使用土壤微生物组对新设计和广泛使用的引物对进行实验比较

(A-C) OTU (A)、属 (B) 和门 (C) 水平的维恩图。不同的颜色代表不同的引物组。重叠代表群体之间的共同分类群；非重叠部分代表每个组中的独特分类群。

(D-E) 使用四种不同的引物组破译的相对丰度。土壤菌群在门水平(D)和纲水平(E)的物种组成。所展示菌种的相对丰度高于1%，箭头指示的是不同引物对差异扩增的菌种。

实验检验引物对解析植物内生细菌组的可行性

Experimental evaluation of designed primer sets in deciphering plant endo-bacteriome

我们将引物对322F/796R和799F/1107R应用于水稻不同组织的内生细菌组测序解析，结果表明，322F/796R 在应用于含菌量较低的植物叶片样本时，其扩增产物中含有高比例的Mt18S (图3A)，表明引物322F不能高效避开对Mt18S的扩增。我们对引物322F进行改造，将其次末位碱基突变为与Mt18S不同的碱基，得到322F-Drs。322F-Dr/796Rs和799F/1107R的扩增子文库中植物源Ct16S和Mt18S的序列占比均低于5%(图3B&C)，表明322F-Dr/796Rs和799F/1107R能够高效地避开对植物源DNA的扩增，实现对水稻内生细菌组的特异性扩增。并且，以水稻叶片为材料，我们分析比较了引物对322F/796R和322F-Dr/796Rs的菌群解析能力，结果发现，改造后的322F-Dr/796Rs对植物内生细菌组的解析能力与322F/796R相似。

图 3 被设计的引物组在避免植物 DNA 污染方面的实验评估。

(A-C) 细菌16S、水稻Mt18S和Ct16S在引物对322F/796R (A)、799F/1107R (B)和322F-Dr/796Rs (C)的扩增子文库中的占比。R: 水稻根组织，L: 水稻茎叶组织;；

(D-F) 不同群体的 Alpha 多样性指数(322F-796R 和 322F-Dr/796Rs)；

(F) 基于 Bray-Curtis 距离的 PCA 表明，所有五种不同的引物组，当应用于相同的叶子样品(三个样品进行了测序)时，对微生物群落结构产生了相似的结果。

缩写：R 和 L 分别表示水稻根和叶。G、322F/796R；A、322F-A/796R；T，322F-T/796R；C、322F-C/796R；H、322F-H/796R。

通过序列比对分析和实验验证，我们发现，322F-Dr/796Rs和799F/1107R不仅可以应用于水稻，而且能够应用于多种植物的内生细菌组测序解析，包括拟南芥、番茄、柑橘等(图4)。

图 4 被设计的引物组通过实验应用于其他植物的内生细菌组

由 322F-A/796R (A) 和 799F/1107R (B) 生成的拟南芥、番茄和橙子的每个扩增子文库中植物 DNA(Ct16S 和 Mt18S)的比例。

QPCR定量分析植物组织含菌量

Quantification of rice endophytic bacteria by qPCR

由于322F-Dr/796Rs和799F/1107R的扩增子文库中植物细胞器DNA占比非常低，所以，可以直接应用于植物组织内生细菌的qPCR定量分析。根据水稻的内参基因和322F-A/796R计算得到水稻叶、根两种组织内生菌群的相对含量(图5A)。然后，我们设计实验制作了qPCR反应中植物组织细菌含量与qPCR反应Ct值的标准曲线(图5B)。根据这一标准曲线，进一步计算得到水稻不同组织的绝对含菌量(图5C)，实现了对植物内生菌群和植物相关菌群在核酸水平的的非培养法绝对定量。

图 5 水稻不同组织内生细菌含量的qPCR分析

(A) 叶和根内生微生物群的相对定量。从使用引物 322F-A/796R 扩增的 16S 的拷贝数计算细菌数。从使用引物 OsActin-F/OsActin-R 扩增的水稻肌动蛋白基因的拷贝数计算植物细胞数。

内参基因为水稻actin。纵坐标值=2^{-(Ct(actin)-Ct(322F-A/796R))};

(B) 通过在 10³ 至 10⁷ CFU 的范围内绘制平均 Ct 值与标准细菌数的 10 倍系列稀释度而生成的标准曲线。

(C) 水稻叶和根内生细菌的绝对定量。细菌密度计算为每克水稻叶或根鲜重的细菌细胞数。提取过程中的 DNA 损失率为 66.7%–90%，被排除在细菌密度的计算中。平均值和标准偏差由三个独立实验计算，每个实验使用五株植物。

讨论

解决16S-seq中植物源DNA污染的方法还有很多，比如：使用细菌16S rDNA的通用引物，测序后滤除宿主序列；利用肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)或者锁核酸(locked nucleic acid, LNA)作为PCR夹钳在第二轮PCR扩增过程中阻断植物源DNA的延伸；利用CRISPR/Cas9 系统中Cas9 核酸酶和特异性向导RNA(gRNA)在第二轮PCR扩增过程中靶向消除植物源DNA序列。相比于这些方法，我们开发的方法最大的优势在于：由于直接在引物上做设计，不需要格外添加辅助元件，因此，操作简便，并且能够直接应用于菌群含量的qPCR检测。16S-seq与定量结果相结合，能够揭示更加真实的菌群组成结构。

一作简介

第一作者：陈丽莹，浙江大学农业与生物技术学院博士研究生，主要关注植物内生细菌组的非培养法检测鉴定，内生细菌组测序分析，内生细菌组与植物适应性功能等。目前以第一作者发表了1篇Sci China Life Sci，并获得多项发明专利。

通讯作者

方荣祥 研究员、博导，农业微生物与生物技术研究室主任，中国科学院院士，第三世界科学院院士，第五届国家重点基础研究发展计划(973计划)专家顾问组成员，第11、12届中国人民政治协商会议全国委员会委员。长期从事植物病毒学和植物生物技术的基础研究和应用基础研究。完成了花椰菜花叶病毒(新疆株)和水稻黄矮病毒基因组全序列分析，确定了植物弹病毒负责细胞间运动的蛋白。研制成同时抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的转基因烟草，在种植时间和规模上曾居国际领先；同样的策略还用于抗病毒辣椒的研制。在植物生物技术的基础研究方面，分析和改造了花椰菜花叶病毒35S启动子，研究结果被广泛应用；阐明了利用人工小RNA抵抗植物病毒侵染的新策略。1987年以来获中国科学院科技进步一等奖2项，中国科学院科技进步二等奖3项，河南省科学进步二等奖1项；1994年获国家“有突出贡献的中青年专家”称号；2005年获何梁何利“科学与技术进步奖”。2016年获中国植物病理学会终身成就奖，在国内外学术期刊上已发表论文130余篇，国际专利1项，国内专利授权13项，国内专利公开1项。

张莉莉，中国科学院微生物研究所研究员，博士生导师，中国科学院“生物互作卓越创新中心”青年骨干。2007年07月于中国科学院微生物研究所获得遗传学博士学位，2008年02月至2014年01月为耶鲁大学医学院博士后，2014年02月全职回国。致力于虫媒病致病机理与微生物组抗病策略研究。通过蜱虫-伯氏疏螺原体/发热伴血小板减少综合征病毒-人、灰飞虱-水稻条纹病毒-水稻三者互作体系，比较研究动植物虫媒病致病机理，以水稻种传微生物组开发农作物抗病促生新策略。在Trends in Plant Science，PLoS Pathogens等国际著名期刊发表科研论文数十篇，申请国家发明专利8项，授权专利3项，参与编写中国科学院大学教材1部。

Reference

Liying Chen, Mengting Zhang, Da Liu,Hongbo Sun,Jianxiang Wu,Yan Huo,Xiaoying Chen,Rongxiang Fang,Lili Zhang.Designing specific bacterial 16S primers to sequence and quantitate plant endo-bacteriome. Sci China Life Sci 64(2021). https://doi.org/10.1007/s11427-021-1953-5

SCLS：微生物所方荣祥/张莉莉团队开发植物内生细菌特异16S引物