非结核分枝杆菌菌种鉴定的现状及研究进展
非结核分枝杆菌(non—tuberculous Mycobacteria，NTM)是抗酸染色阳性的一类分枝杆菌，对人类致病性较结核分枝杆菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能发生障碍则可导致病变，致病菌或条件致病菌常发于老年人或免疫力低下者，种类较多，已多达170余种，不同的NTM感染可引起不同的NTM病。如何快速、准确鉴定NTM菌种是诊断和治疗该类疾病的关键，传统的分枝杆菌菌种鉴定方法不仅耗时长，而且操作繁琐，随着分子生物学技术的发展，各种新的鉴定菌种方法目前已经逐渐成熟。为了提高对分子生物学技术鉴定分枝杆菌的认识，现将NTM菌种鉴定的现状及研究进展综述如下。
NTM广泛分布于自然界中，目前还无法证明非结核分枝杆菌可在人与人之间传播，近年来NTM的感染率逐年上升，国内不同地区已有相关报道，不同地区NTM流行特征存在一定的差异。张洁等用PCR荧光探针法对北京结核病控制研究所菌株库中保存的2009年的1 552株和2013年的1 553株分枝杆菌菌株进行菌群鉴定，NTM分离率分别为3.8%和4.6%，共鉴定出菌种13种，其中胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌比例最高，分别为39.2%和37.7%。NTM感染者中，男87例，女43例，平均年龄55岁，60岁及以上占40%。可见，北京地区NTM的分离率保持基本稳定，略有上升。NTM菌种以胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主。北京NTM分离者以男性居多，感染人群未呈现老年化趋势。吴海良等用Bactec MGTT960系统培养出的40株NTM用基因芯片分型，分离率最高的是胞内分枝杆菌，景辉等报道山东省36株非结核分枝杆菌中胞内分枝杆菌株占29株，分离率为80.6%，二者报道均显示山东省NTM的流行菌株以胞内分枝杆菌株为主。张鑫等采用16srRNA基因测序技术对43株NTM菌株进行菌种鉴定，结果显示甘肃省非结核分枝杆菌群以胞内分枝杆菌为主。潘永等报道2014—2016年徐州医科大学附属徐州市传染病医院收治的NTM肺病患者152例，从痰液标本中分离鉴定出7个NTM菌种，其中以龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌复合群为主。黄明翔等报道的649株NTM菌株中菌株数量前3位菌种为：胞内分枝杆菌302株(46.5%)，鸟分枝杆菌138株(21.3%)，脓肿分枝杆菌81株(12.5%)。显示鸟-胞内分枝杆菌复合群为福建省NTM的主要流行菌种，占总数的67.8%。吴亦斐等的研究报道表明杭州地区NTM的主要流行菌种以胞内分枝杆菌为主，而沈瑶杰等报道上海地区综合性医院分离的NTM中则以脓肿分枝杆菌为主。杭州的NTM感染者中，男性多于女性，男性占62.6%，年龄分布19～96岁，50岁以上人群占80.4%，说明杭州地区NTM感染人群已呈现老年化趋势。平国华等报道显示宁波地区优势非结核分枝杆菌群以胞内分枝杆菌为主。根据金法祥等的报道，绍兴地区NTM 种类已多达14种，以胞内分枝杆菌居多，广州地区NTM菌群分布以龟-脓肿分枝杆菌复合群和鸟-胞分枝杆菌复合群为主，而湖南省NTM 菌群分布以胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌为主。
总之，不同地区NTM的分离率有所不同，根据相关报道NTM的分离率为南方高于北方，气候温暖的地区高于气候寒冷的地区，沿海地区高于内陆地区。NTM种属分布通常有地域特点，不同国家报道的NTM菌种组成和构成比例存在一定的差异。在美国，80%的NTM肺病为鸟胞内分枝杆菌复合群感染，在英国，由鸟胞内分枝杆菌复合群感染引起的NTM病占43%，在亚洲，鸟胞内分枝杆菌复合群感染率为56%，脓肿分枝杆菌的感染率为35%。东亚地区NTM菌种分布最多的是MAC(67%)，东北亚地区如日本和韩国尤其多见；快生长NTM如脓肿分枝杆菌在中国大陆和台湾地区、新加坡较其他国家和地区较为多见，但欧洲和北美很常见的玛尔摩分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌在东亚地区却鲜有报道；现有的文献提示我国分离最多的NTM菌种为胞内分枝杆菌，在北方可达40%～60%，而南方地区除了鸟-胞内分枝杆菌外，脓肿分枝杆菌也占较高比例，与北方相比，南方的NTM种类更具有多样性。
传统的分枝杆菌菌种鉴定方法有对硝基苯甲酸生长实验、噻吩-2-羧酸肼生长实验、硝酸还原实验、5%氯化钠（NaCl）培养基实验、谷氨酸纳葡萄糖琼脂培养基生长实验、麦康凯琼脂培养基生长实验、尿素酶实验、芳香硫酸酯酶实验等，目前最常用的方法为对硝基苯甲酸对硝基苯甲酸生长实验，仅能鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，不能鉴定NTM的菌种水平。
2.1对硝基苯甲酸生长实验 该方法在我国广泛开展。绝大多数的NTM菌种在含有500 mg/L 对硝基苯甲酸的罗氏培养基上能够生长，而结核分枝杆菌却不能生长，相关文献报道显示对硝基苯甲酸生长实验用于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别结果稳定可靠。也有少量报道某些NTM在对硝基苯甲酸培养基上不生长的情况，但所涉及的菌种多数在临床并不常见，因此对该方法的总体可靠性影响有限。部分学者报道结核分枝杆菌存在耐受对硝基苯甲酸的情况，但均缺乏后续的确认研究，可靠性仍有待于证实。
2.2 MPT64抗原检测法 MPT64抗原是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时主要分泌的蛋白之一，NTM在液体培养中生长不分泌此蛋白，由此可以对培养出的分枝杆菌进行初步菌种鉴定。目前已有多种相关商业检测试剂上市，大多采用免疫层析法检测液体培养基中是否存在MPT64抗原，具有操作简单、用时短等优点。从报道的数据显示，就初步鉴定MTB与NTM而言，此技术具有很高的敏感度(多数报道超过97%)和特异度(多数报道超过97%)。M1G64抗原检测法用于检测分枝杆菌在生长过程中是否分泌MPT64抗原，因此需要首先获得阳性培养物；当MTB编码MPT64抗原的基因发生突变时，会出现假阴性结果，这种情况的发生率小于3%；有些M.bovis BCG株(如巴斯德株、哥本哈根株等)缺乏分泌相应抗原的能力，检测呈阴性结果；检测敏感度与MPT64抗原的分泌量有关，有些情况下获得阴性结果的标本延长培养时问后可获得阳性结果；个别NTM菌种，如海分枝杆菌和浅黄分枝杆菌可产生微量MPT64抗原，因此检测呈弱阳性结果；当MTB与NTM共同生长时，将报告阳性结果，因此无法反映NTM的存在。
2.3核酸扩增试验 即通常所说的聚合酶链反应(PCR)技术。目前已经有多款用于结核病诊断的PCR试剂盒上市，其扩增的靶序列通常为是结核分枝杆菌中特异性的DNA序列。将PCR技术与涂片和培养结合可用于NTM的初步筛查。对于涂片阳性或是培养阳性的标本，平行的PCR扩增获得阳性结果提示样品有结核分枝杆菌存在，如果PCR为阴性结果提示存在NTM的可能，但需要进一步证实。
2.4高效液相色谱法 可鉴别一些慢生长型的NTM，但无法鉴定新的非结核分枝杆菌。
2.5吖啶酯标记的DNA探针测定法 通过特异性探针与分枝杆菌的16SrRNA杂交获得阳性结果，仅能鉴定少数的非结核分枝杆菌。
2.6PCR-限制性核酸内切酶分析 经过扩增后的DNA片段具有高度的特异性，然后通过酶切消化，再经放射白显影或染色技术检测出不同的分枝杆菌菌种。该技术法可直接用于临床标本分枝杆菌的菌种鉴定。
2.7DNA测序技术 又称基因测序技术，通过测定DNA的序列可鉴定出大多数的分枝杆菌，值得注意的是有些非结核分枝杆菌间存在相似的16SrRNA 碱基序列，容易产生误判。
2.8DNA焦磷酸测序技术 利用焦磷酸测序技术不仅可检测临床分离分枝杆菌的16SrRNA核苷酸序列，还可检测结核分枝杆菌的耐药性，且5 h内可出结果，具有快速、准确、高通量的优点，是一种快速检测分枝杆菌和结核分枝杆菌药物耐药性的方法。
2.9基因芯片技术 也称为DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸阵列技术，采用基因芯片微量点样技术，将检测分枝杆菌基因的特异探针固定在芯片上，检测探针和对照探针各重复5个点，形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个相同的微阵列，每个微阵列可检测一份样本。根据探针在芯片上的特定位置排布，可以分析相应被测细菌的相关信息，从而判别被测细菌的种类。
美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)曾推荐部分NTM菌种的药敏试验方法和药物临界浓度，这些方法至今还没得到临床的充分评价。进行没有金标准的药敏试验时，一般情况下慢生长分枝杆菌选取结核分枝杆菌的临界药物浓度各种分枝杆菌的耐药临界浓度可能有所不同，因此需要做适量的临床基础研究才能获得可靠的药敏试验方法。从当前的一些报道得知， NTM对药物的敏感性取决于不同的种类。当同一菌种不同菌株对药物的敏感性存在分化时，才需要做药敏试验。NTM的药敏试验应在菌种鉴定的基础上进行。各种NTM的耐药临界点存在较大差异，如MAC对克拉霉素的耐药临界点为32 mg/L，而快速生长分枝杆菌对克拉霉素的耐药临界点则为8 mg/L，没有进行菌种鉴定的药敏结果可能会造成治疗方案的误导。药敏试验前要分析NTM与临床的相关性。临床相关性较低的NTM不要做药敏试验，以免造成医疗资源的浪费。
由于NTM属于条件致病菌，自然界中广泛存在，我们分离出的非结核分枝杆菌不一定能够提示非结核分枝杆菌病，必须结合临床进行综合分析。根据美国胸科协会发布的NTM肺病诊断标准，对鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等常见致病的非结核分枝杆菌可作出诊断，但偶然分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌等较少致病的非结核分枝杆菌需谨慎。从各类样本中分离NTM时应考虑临床的相关性。首先要注意分离出NTM的菌种，目前有文献报道临床相关性较高的NTM包括玛尔摩分枝杆菌(95%)、苏尔加分枝杆菌(76%)、AC(56%)、脓肿分枝杆菌(35%)和龟分枝杆菌(31%)，与临床相关性较差NTM有登分枝杆菌和土分枝杆菌(1%～3%)。美国第一次NTM流行病学调查显示，NTM病患者中分离率最高NTM为海分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌，其次是苏尔加分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群和龟-脓肿分枝杆菌，未见戈登分枝杆菌和土分枝杆菌与临床相关。另外要注意分离出NTM的样本，从无菌部位留取的样本分离出的非结核分杆菌通常可判断与疾病相关，但从非无菌部位留取的样本（如痰和支气管灌洗液）中分离的非结核分枝杆菌需要污染或定植的可能。例如，血培养时分离出分枝杆菌可作出相应的疾病诊断，但痰或支气管灌洗液中分离出的分枝杆菌需要考虑标本污染或呼吸道定植的可能。其次要注意不同地域的差异，蟾蜍分枝杆菌在欧洲和加拿大通常会致病，但在美国却很少致病，胞内分枝杆菌在荷兰很少致病而在美国德克萨斯通常会致病，鸟分枝杆菌在荷兰通常致病而在美国德克萨斯很少致病。因此，开展NTM不同地区临床相关性研究是非常有必要的。通过NTM临床相关性的研究可获得不同地区NTM的菌种分布及感染情况，推断出相关不同种类NTM致病的可能性，发现一些NTM疾病相关的人口学、合并疾病和影像学特征，为各种NTM感染性疾病的临床诊断提供实验室依据。
NTM可引起人体各部位的感染，以肺部感染最为常见，约占NTM感染的90%，其次相对较常见的部位包括淋巴结、皮肤软组织、骨以及全身播散性病变，中枢神经系统、角膜和耳部感染的也有相关的个案报道。在不同类型的临床标本中，痰、支气管肺泡灌洗液、肺活检组织获得NTM的分离率最高。肺部NTM感染最常见的菌种有MAC、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌。肺外感染NTM以淋巴结最为常见，特别是年幼儿童，最常见的是MAC，其次是瘰疬分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌；骨关节感染NTM较为罕见，且以MAC、苏尔加、偶然、蟾蜍、海等分枝杆菌为主可能性最大。NTM感染人体皮肤软组织通常与特定人群有关，感染发生前往往有过外伤、手术或皮肤美容护理的经历，其中海分枝杆菌感染易见于水产业人员，也有龟分枝杆菌或偶然分枝杆菌引起伤口感染的报道，溃疡分枝杆菌和脓肿分枝杆菌可引发皮肤感染。目前在艾滋病患者中，由鸟分枝杆菌引起的感染最为常见，而由堪萨斯分枝杆菌和其他分枝杆菌引起感染的报道也逐渐增多。
虽然目前菌种鉴定水平已能够满足临床的主要需求，但随着新菌种的不断发现，持续提高菌种鉴定水平仍需我们广大医务人员作出相应的努力，近年来，NTM病相关报道日趋增多，显示了NTM病已成为威胁人类健康的重要公共问题，部分NTM病的研究也取得了一定的进展，随着分子生物学的发展，我们会发现越来越多的NTM菌种，人们对NTM病的认识逐步加深。基因芯片技术是一种新型核酸检测方法，可快速进行分枝杆菌的菌种鉴定，随着该技术的广泛应用，目前已有许多学者对其进行研究报道，基因芯片技术检测分枝杆菌的优点已经逐渐得以证明。尽管如此，NTM感染问题仍然十分突出，不管是实验室诊断还是临床治疗都还存在很多困难，需要实验室人员和临床医生认真的面对。
作者简介：唐柳生，大学本科，副主任技师，研究方向：结核病实验室检查
文献来源：唐柳生.非结核分枝杆菌菌种鉴定的现状及研究进展[J].慢性病学杂志,2019(6):831-834.