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The application of weighted gene co-expression network analysis in identifying key modules and hub genes associated with disease status in Alzheimer’s disease运用加权基因共表达网络分析鉴别与阿尔茨海默病疾病状态有关的关键模块和hub基因
一、研究背景
阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，以进行性记忆丧失和认知退化为特征。β-淀粉样蛋白组成的细胞外淀粉样斑块沉积和tau蛋白组成的神经元内神经纤维缠结（NFTs）是AD的主要病理变化。
基于缠结神经元的位置和修饰，可以将AD分为6个阶段，即Braak分期——I&II：过渡内嗅区阶段 (transentorhinal stages)，无临床症状；III&IV：边缘区阶段(limbic stage)，为AD初始阶段；V–VI：新皮层阶段(neocortical stages)，为发育完全的AD。简易智力状态检查（MMSE）是一种筛选和检测痴呆进展的认知测验，得分低于24分表明可能患有痴呆，非痴呆老年人得分通常在24分或以上。NFT评分系统是另一种相关的衡量标准，通常与Braak分期一致，NFT III期提示AD。
二、分析流程
三、结果解读
1.识别基因共表达模块
由于检查全基因组表达数据的共同挑战是管理批次效应，因此有必要在无法进行样品完全相似处理的情况下，持续监视批次效应。通过R包limma的normalizeBetweenArrays()函数对数据进行归一化，在筛选出75%的最高中值绝对偏差(MAD)的基因后，从GSE1297得到9974个基因用于WGCNA分析。为了确定GSE1297的样本是否适合网络分析，作者首先研究了样本的亲缘关系树图和临床特征，用R包的hclust函数对样本进行聚类分析，如图1A所示，所有的样本都出现在聚类里，没有异常值。为了确定软阈值，作者选取1-20作为阈值进行网络拓扑结构分析（图1BC），当阈值为6时（scale-free R2 =0.872），基因共表达网络为无标度的拓扑结构，具有完整的模块特征。
图1.样本聚类及软阈值的检测
然后作者用拓扑重叠矩阵（TOM）构建平均连锁层次聚类，并根据相异度（1-TOM）对共表达模块进行划分，得到了16个功能模块（图2）。接下来，作者用MEs（module eigengenes）的eigengene相关性计算了16个模块间的相互作用关系，并可视化为热图（图3A），颜色越深代表模块间连接度越大。结果表明，各个模块的个性水平较高、模块中基因表现出相对独立性。
图2.根据相异度分组的基因的系统树图
图3.鉴别与AD临床特征关联的模块
2.模块和临床特征的相关性
为了探究这些功能模块是否与疾病状态有关，作者研究了每个功能模块与MMSE、BRAAK、NFT、死亡时间（PMI）、年龄等AD临床特征的关系。分析发现，一些模块与AD的疾病状态高度相关（图3B中的lightcyan，pink，salmon和blue模块），且这16个模块大致可以分为2组（图3C）。从图3B可以看出，与其他模块相比，MEpink模块与所有疾病状态（NFT，BRAAK，MMSE）均显著关联，提示其在AD的发生发展中必不可少。因此，作者接下来聚焦于Mepink模块。
MEs是通过主成分分析计算得到的主要关键成分，主成分分析将特定模块的基因表现概括为单个特征表达谱。通过基因显著性（GS）和模块显著性（MS）量化相关模块的基因表现，得到pink模块与BRAAK、NFT、MMSE的相关性（图4ABC）。然后用Cytoscape可视化模块pink的基因网络（图4D），得到6个hub基因（AACS、GRIK1、HOXB2、KCNF1、MYBL1、RAP1GAP2）。
GS：第i个基因型xi和样本临床特征T的Pearson相关性，GSi = |cor(xi , T)|。MS：模块中所有基因的平均GS。kme衡量模块中基因和ME间的相关性：kme(i) = |cor(x(i),ME(q))|，模块中kme高的基因定义为模块内hub基因。
图4.模块Mepink基因的临床意义和功能分析
3.功能模块基因的功能富集分析
相似表达模式的基因可能参与相同的生物学过程或生物学网络，因此作者用DAVID对pink模块的基因进行GO富集分析。结果表明（图5），模块中基因多数在中枢神经系统发育、PI3K信号通路调节和离子跨膜转运中富集。
图5.pink模块的GO分析
4.hub基因的效能
作者在GSE28146验证集中用hub基因进行样本的层次聚类分析，发现这些基因可以区分严重和非严重的AD样本（图6A）。因此进一步用ROC曲线分析hub基因对AD样本的区分能力，pink模块的hub基因AUC值大于0.7，说明hub基因区分AD样本的特异性和灵敏度高。
图6.hub基因的效能评估
5.GRIK1在AD皮质和AD海马区上调，并减短原代神经元的树突长度
最后，作者用qRT-PCR和WB检测了hub基因GRIK1在AD皮质和AD海马的表达水平。结果表明，与正常人相比，GRIK1的mRNA和蛋白水平在AD患者皮质和海马区表达升高。而Phalloidin染色结果显示GRIK1 pCDNA3.1组的树突长度比对照组短（图7）。这些数据共同说明，GRIK1在AD皮质和海马区表达上调，且缩短原代神经元的树突长度。
FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。
图7.原代神经元的phalloidin染色
小结
本篇文章中，作者选取GSE1297和GSE28146两个数据集进行研究，这两个数据集主要包含AD早期阶段的样本。利用GSE1297数据集筛选AD相关模块和基因，GSE28146数据集进行独立验证。经过标准化、归一化等过程，最终得到9974个基因用于WGCNA分析。然后，作者采用dynamic tree cut方法识别得到16个共表达模块。通过与临床特征的关联分析，发现粉色模块与AD疾病阶段相关性最强。于是作者聚焦于粉色模块，构建基因网络获得了6个hub基因（AACS、GRIK1、HOXB2、KCNF1、MYBL1、RAP1GAP2）。作者选取GRIK1基因进行进一步的研究，在AD小鼠模型中证实其表达水平升高，且转染细胞中GRIK1可以缩短神经元轴突长度。此外，聚类分析发现粉色模块可以区分验证集中不同阶段的AD样本。总的来说，这些结果有助于提高对AD发病机制的认知。