GSK开发首个非核苷酸类可静脉注射的新型STING激动剂
本文译自最近一期Nature，结合SITC 2018上STING数据，别有一番风味。
现在还很难评价这个化合物在临床上能走多远，因为既要考虑到单药的效果还要考虑现在流行的免疫联合治疗的前景。但是这个研究为我们的基础研发可能提供了一个思路，从最开始筛选出的其实我认为并不算理想的化合物，如何利用靶点的天然特征再加上优化，得到一个全新的可能更优的化合物，所以也可以看出现在的药物开发绝对不再是一个单学科的工作，研发工作者更需要有跨学科的知识。小和尚写完唯一后悔的就是当时没有好好学习，书到用时方恨少。
前言
研究简述
首先筛选出ABZI（化合物1）可以竞争结合STING
STING结合化合物1的晶体结构分析
基于结构设计出diABZI（化合物2）
化合物2的亲和力大幅度提升
化合物2的体内效应及局限性
STING的构象在激活中的作用依旧未知
在化合物2的基础上进一步优化出化合物3
化合物3最终引发适应性免疫发挥抗肿瘤效应
小结
前言
干扰素刺激基因（STING）作为存在于内质网的受体能够感知细胞质中病原或者自身的DNA来传导天然免疫信号。目前针对STING调控研发的化合物主要集中在治疗肿瘤、感染和疫苗佐剂领域。众所周知，现在的尝试主要在开发修饰的环二核苷酸(CDN)来模拟STING的内源配体cGAMP，现在进入到临床上的都是用瘤内注射的方式治疗实体肿瘤可触及的患者。本文报道了一种在小鼠中系统性给药有效的非CDN类小分子激动剂。研究人员开将两个对称的苯并咪唑（ABZI）连接起到协同效应，产生了二聚化的ABZI（diABZIs）增强了结合STING的能力。将diABZI静脉注射到携带同源结肠癌的免疫活性小鼠中，引起很强的抗肿瘤效应，包括完全和持续的肿瘤消退。这个发现可能是快速发展的免疫修饰治疗领域的里程碑。
研究简述
随着多个靶向PD-1、PD-L1等免疫检查点抑制剂在多个瘤种里证明了疗效，免疫治疗已经改变了肿瘤治疗的方法。除了直接针对获得性免疫应答，寻找其他免疫调节剂的探索已经自然而然的延伸到天然免疫领域。环磷酸鸟-腺苷合成酶（cGAS）-STING逐渐成为在其他诸如Toll样受体（TLR）通路等增强肿瘤免疫原性的天然免疫感知系统之外的一个重要的固有的肿瘤感知机制。肿瘤来源的DNA激活cGAS产生STING的天然配体cGAMP，诱导了下游的级脸放大：通过招募丝/苏氨酸蛋白激酶（TBK1）磷酸化干扰素调节因子3（IRF3）产生1型干扰素和其它促炎因子。1型干扰素选择性地刺激抗原交叉呈递并动员CD8+ T细胞，主导了获得性免疫抗肿瘤的疗效。同源肿瘤模型中选用瘤内注射环化核苷酸在药理学水平激活STING病取得有效持久地肿瘤消退。尽管如此，还没有报道过有合成的小分子STING激动剂对人肿瘤有活性并且适合系统性给药。
首先筛选出ABZI（化合物1）可以竞争结合STING
为了鉴定出可以调控STING功能的配体，研究人员用高通量筛选小分子去和放射性标记的cGAMP竞争结合STING的CTD（aa 149-379）。
表 ：用3H-cGAMPSPA检测技术筛选GSK的小分子库中大约1.8 × 106个化合物(10 µM)
鉴定出一系列的小分子ABZI类化合物可以中度还可重复的抑制3H-cGAMP结合STING，例如图1中的化合物1在10µM时的抑制是59±8%，其表观抑制常数IC50APP约14±2 µM。另外图b的热稳定性分析中化合物1在16µM浓度以上时能够以ΔTm(50% unfolded)1.5℃来稳定未折叠的构象，这也是理想的STING配体的特点。
STING结合化合物1的晶体结构分析
STING蛋白中朝向胞质的CTD形成一个同源二聚的复合体，通过氢键和水分子介导的相互作用来形成一个大的结合口袋来与cGAMP相互作用，为了进一步弄清STING结合ABZI类化合物的特征，研究人员解析了分辨率1.91 Å的化合物1结合STING CTD的晶体结构（晶胞参数下图左，左右c和d分别化合物1结合STING CTD二聚体的整体与细节，其中CTD单体分别显示为绿色和粉色的cartoon，化合物1显示为stick颜色同结合的STING CTD），可以看出在图c的STINGCTD二聚体形成的口袋中，结合了相邻的两个化合物1，每个小分子各自结合1个STING亚基，整个口袋边缘的延伸并没有交叉接触二聚体的界面；而在图d中1-乙基-3甲基-1-氢-吡唑-5-氨甲酰部分
结合在口袋的底部，其中甲基插入L159和T267形成的疏水裂缝（图中未显示，可查看PDB file），而吡唑环上的N原子和S162的羟基形成了一对关键的氢键，氨甲酰上的羰基也和T263形成了氢键；除了这些，化合物1中另一端的酰胺集团也和口外之外的S241形成了2对氢键的网络，但这是个结构无规则并且相对开放的位置。
基于结构设计出diABZI（化合物2）
共结晶的结果显示：化合物1中的N-1基团【-CH(OH)-Ph】空间结构上两两接近，也落在结合口袋中，但是和STING蛋白也没有相互作用，因此研究人员就想把这个羟甲苯基替换成linke从而将两个ABZI连接成一个新的二聚分子，希望在亲和力上能够有大的提升。为了验证这个假设，研究人员合成了化合物2——二聚ABZI/di-ABZI，分子结构见下图，发现di-ABZI将结合能力提升了将近1000倍，IC50APP 大约20±0.8 nM。
ABZI连接后效价的显著提升反映了2点，新的分子中：1）原本的ABZI的朝向得到了保持；2）linker避免了不利于结合蛋白的相互作用。解析的2.4 Å的化合物2结合STINGCTD的结构确认了化合物2保持了原本的化合物1结合STING的方式，另外linker和STING之间确实没有发现相互作用。
化合物2的亲和力大幅度提升
除了证明对CTD有强亲和力外， LC-MS/MS也能检测到化合物2还能拉下结合在化合物5(化合物2的衍生物)上的来自THP-1细胞裂解液中的全长STING蛋白，化合物2浓度提高能竞争掉化合物5的结合，KdAPP大约1.6nM这支持这一点（下图左）。
图右：为了排除任何的脱靶倾向，下面用亲和富集蛋白组学技术验证化合物2的亲和力。这里将有活性的化合物2的类似物——化合物5共价固定在琼脂糖beads上，利用亲和力来从THP1细胞裂解液中捕获潜在的靶点蛋白。后面在没有添加化合物2以及在不同浓度的化合物2存在时用pull down实验确定靶点蛋白。所有由beads捕获的蛋白在洗脱后经胰酶处理的同位素标记定量，最后由LC-MS/MS分析画出竞争-结合曲线并计算确定IC50。
实验中测得的IC50代表了结合靶点的亲和力，不过会受靶点结合固定在beads上的配体的影响，但这个可以通过剔除了beads上配体和靶点来排除这部分影响，比如用表观解离常数KAPPd。最终只有两个蛋白被捕获并在1000倍的窗口内完成剂量相关的研究，分别是STING和血清类粘蛋白ORM1(α1-酸性糖蛋白前体)。STING的KAPPd大约1.6nM，说明化合物不仅结合截短的重组STING CTD，也能结合内源的全长STING。唯一鉴定出的脱靶蛋白ORM1的KAPPd大约79nM，这是一个由单核细胞表达的急性期反应物，存在于血浆，已知有药物结合的特征，所以选择窗口40多倍可以接受。
总结一下，研究人员利用STING蛋白的对称性质利用连接策略设计出一个新的对能够竞争掉cGAMP结合STING的具有高度亲和力的配体。
化合物2的体内效应及局限性
cGAS合成的cGAMP被STING感知并激活STING依赖的免疫系统，诱导1型干扰素和促炎细胞因子的分泌。为了明确结合后的功能，研究人员将人外周血单核细胞（PBMCs）和化合物2混合孵育测量STING的磷酸化、转录因子IRF3的磷酸化和细胞因子的分泌，信号通路见下图。
研究发现，STING和IRF3的磷酸化水平随着化合物2的剂量增加而提升（下图左），但是加入TBK-1激酶抑制剂BX795（从上图可知，TBK-1催化STING和IRF3的磷酸化）后，两者的磷酸化水平显著下降到未结合化合物2的状态。
和cGAMP类似，化合物2能够以剂量依赖的形式诱导IFNβ的分泌，表观效应常数EC50APP约3.1±0.6μM，有效性差不多是cGAMP的18倍（EC50APP约53.9±5μM），见下图左。但是EC50和下图右所示的IC50相比相差2个数量级，很大程度上是因为这两类分子难以穿过细胞膜。
除了IFN-β以外，化合物2还能促进IP-10（INF-γ诱导的蛋白10）、IL-6和TNFα的释放，也是依赖于STING介导的TBK-1激活的形式——右图中，随着BX975处理剂量的增加，这些因子的响应逐渐降低。
STING的构象在激活中的作用依旧未知
先前解析的STING结合不同的CDN和DMXAA（鼠源STING 配体，不激活人STING）的复合物结构中，配体诱导了一个封闭构象并激活STING（也就是说从未结合配体时的open—>closed）。 与之不同，化合物2/diABZI激活STING的功能时始终使STING保持一个开放构象。
为了确认STING结合化合物2后在溶液中是否也是一个开放的构象而不是由于晶体堆积（packing）引起，本文用氢氘交换质谱技术研究STING CTD在结合cGAMP活化合物2后以及未结合任何配体的构象。不出所料，单独的STING在结合口袋开口区域的Q226到Y241的氢氘交换速率很快，而一旦结合cGAMP后交换速率下降成为一个受保护的环境，这个就和上面左图中STING结合cGAMP后的晶体结构中构象的转变一致。与之相反，一旦结合化合物2后开口区域的氢氘交换没有大的变化，这提高了STING的激活不需要封闭构象的可能性。
将未结合配体的STING与结合cGAMP或者化合物2的结构做一个重叠比较，可以看出：结合化合物2后的构象单独的开放构象相似，但结合cGAMP后结构则不同（注：文章的结果只显示了结合状态的比较，如有兴趣可以将三个结构比较下）。
尽管在构象上有差异，但是结合口袋的底部没有发现明显的差别来解释上述氨基酸位置或者构象的不同是如何驱动STING的激活，就像环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）结合到开放的构象上也能激活STING。此外一些功能获得性突变位于开口区域以外，也能以非cGAMP依赖的形式来激活STING。这些发现加深了STING激活需要开口区域封闭的假说，就像cGAMP介导的激活需要高亲和力结合开口区域来产生封闭构构象，而基于ABZI的激活则支持不需要开口区域封闭的模型。总之，需要更多的研究来弄清STING的构象如何来调控信号通路的激活。
在化合物2的基础上进一步优化出化合物3
经过进一步的优化先导化合物，研究人员得到了一个新的diABZI类分子，化合物3，具有高亲和力、细胞内提升的效能及对人和小鼠的STING有相似的功能活性。
在人外周血单核细胞中，化合物3能够诱导剂量依赖型的STING激活和INFβ的分泌, EC50APP约130nM，效能差不多是cGAMP的400倍，化合物2的20多倍。
由于有TBK1、AMPK、IKK和ULK1在内的多个激酶可以调控STING，研究人员做了一个33P-同位素标记的激酶筛选来测算选择性。1μM浓度下，化合物3对350多个激酶有高选择性，结合其它交叉的靶点筛选，提示化合物3这样的di ABZI类激动剂对STING有显著的选择性。
化合物3最终引发适应性免疫发挥抗肿瘤效应
STING激活后诱导的1型干扰素应答，放大了临近肿瘤细胞的树突状细胞内的干扰素信号通路并且启动CD8+ T细胞的杀伤肿瘤效应。为了评估体内活性，研究人员给野生型小鼠和STING敲除（sting-/-）静脉注射化合物3（cmpd3），可以看到：在野生型小鼠体内cmpd3可以显著的激活INFβ、IL-6、TNF和CXCL的分泌，但是在sting-/-小鼠体内却没有观察到这些，这就确定了化合物3的确是能够在体内激活STING依赖的1型干扰素和促炎细胞因子的分泌。
给瘤内或者腹膜内注射鼠源STING激动剂DMXAA可以引起肿瘤消退，提示系统性地运输STING激动剂可能约束了引起肿瘤消退的相关机制。每天静脉注射高剂量的cGAMP只能引起的体内效应并不算高。而在种入肿瘤4天后，作为预防性的肌肉注射cGAMP也只是暂时的延缓肿瘤的生长。因此亟需发展能够的能系统输送的新型STING激动剂并在人体内保持活性并诱导抗肿瘤效应。
为了评估系统输送diABZI的治疗潜力，研究人员测试在携带结肠肿瘤（CT-26）的同源小鼠模型中静脉注射化合物3。首先确立了3mg/kg注射下的PK参数，见图c：药物系统暴露的半衰期1.4h，达到的血药浓度超过对鼠源STING的EC50（200ng/mL，其分子量870，大约230nM > 鼠STING的EC50 186nM）。接下来按照1.5mg/kg测试间歇剂量，分别在第1、4和8天给皮下CT-26肿瘤约100mm3的小鼠静脉注射化合物3，可以发现：经化合物3处理后肿瘤不再生长而且体积显著降低（p<0.001），另外显著提升生存率，在第43天的时候80%（8/10）小鼠肿瘤消退且存活（图d和e中红线 vs 蓝线）。
为了进一步研究STING信号的抗肿瘤活性以及免疫系统在已发现的上述抗肿瘤效应中的贡献，研究人员用抗鼠CD8的抗体来下调CD8+ T细胞（具体看补充材料的中流式结果，这里不贴图了），发现原有剂量下抗肿瘤效应的显著降低，不管是肿瘤生长的抑制还是最终的生存获益，参照上图d和e中的绿线和紫线。这些数据为化合物3最终激活了适应性免疫介导了持久的抗肿瘤效应并且引起了肿瘤消退提供了坚实的证据。
小结
现在的STING激动剂的临床基本集中在瘤内注射，除了瘤内注射药物的技术挑战外，此类STING激动剂的疗效往往也会因难以抵达实体肿瘤而受到限制。另外在携带多种异质性远端肿瘤的患者中证明有持久的远端效应也是一个大的挑战。针对这些问，本文中研究人员开发了一类新型的小分子STING激动剂，可以静脉注射并在体内引起CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。像文中提到的化合物3这样的diABZI类化合物应该是首类非核苷酸类的有效的STING激动剂，可能会极大的提高人类肿瘤治疗的疗效。