肿瘤细胞难以捉摸？让发育生物学工具包来帮忙
阐明癌症干细胞的分裂和扩散机制，将有助于解释肿瘤是如何生长和逃避治疗的。
Arnold Kriegstein和他的团队观察到，癌细胞能在培养皿中快速移动，在分裂前的1小时内，这些癌细胞有时能够移动其自身长度30倍的距离。通常只有某些胚胎干细胞在胎儿大脑发育过程中能快速移动。而这些癌细胞来自一种非常难以治疗的脑肿瘤——胶质母细胞瘤，这是一种特别难治好的脑肿瘤，部分是因为其扩散极快。
加利福尼亚大学旧金山分校（University of California, San Francisco，UCSF）的发育神经生物学家Kriegstein认为，这种行为暗示了癌细胞与干细胞的相似之处，而干细胞在胚胎发育中非常重要。“重新激活原本只有在胚胎发育中表达的基因程序，往往是细胞癌变的一部分原因。” Kriegstein想研究其中的联系。
Kriegstein小组与UCSF放射肿瘤学家David Raleigh合作，将胶质母细胞瘤样品分为两部分：一部分富含能快速移动的干细胞样细胞，另一部分包含已分化的更成熟类型的癌细胞。研究人员将两部分细胞分别接种于人脑类器官（模仿器官的简化结构）中，预期只有干细胞样细胞组会重建原始肿瘤。但令他们惊讶的是，两组细胞均重建了完整的癌细胞谱系[1]。Kriegstein说：“刚开始时在每个分组中几乎只有一种类型的细胞，但最终却产生了大量异质性肿瘤细胞。这是如何发生的呢？这仍然像一个黑箱。”
脑胶质母细胞瘤病人的小块组织，可用于培养类器官模型，研究肿瘤干细胞在癌症中的作用。。图源：Jessica Kourkounis/The Washington Post
自20世纪90年代以来，研究人员一直怀疑癌症中的干细胞是癌症复发、扩散（或转移）和耐药的关键。但癌症干细胞却似乎难以描述：它们没有明确的分子标记，也可能并非在每个肿瘤中都存在；可能最令人沮丧的是，它们与癌症的侵袭性或治疗效果的关系很小。
“在某些癌症中，几乎所有细胞都起干细胞的作用；而在其他癌症中，干细胞和分化程度更高的肿瘤细胞则具有清晰的层次结构，”阿姆斯特丹大学医学中心的干细胞研究员Louis Vermeulen说，“真正的争议是：在一种癌症中有多少干细胞，以及它们是否总是同一种细胞？”
为了回答这些问题，癌症生物学家正在扩展他们的工具箱。除了改良培养方法（例如Kriegstein的研究小组使用的类器官）之外，研究人员还在开发来自发育生物学的方法。其中之一是谱系追踪，它通常用于追踪胚胎细胞如何生长并分化为成体组织，但也可以揭示单个癌细胞如何重建其肿瘤亲本中的遗传多样性。现在，癌症生物学家正在将该方法与单细胞方法相结合，以便更清晰地了解癌症干细胞是否以及如何引发疾病。
不断扩展的培养方式
Kriegstein和Raleigh之所以决定使用类器官，是因为缺乏好的动物模型（例如，胶质母细胞瘤很难在小鼠和大鼠中培养），类器官也比啮齿动物更能代表人类的组织环境，而且使用起来非常容易，Kriegstein团队的前博士后研究员Aparna Bhaduri说。通过显微镜观察，研究人员只需将肿瘤细胞移至类器官表面，然后等待约45分钟即可形成肿瘤。Bhaduri认为这比动物实验要容易得多。
但Bhaduri认为，类器官仍然无法替代动物，特别是因为其在结构上缺乏血管，因此无法发现肿瘤与循环系统的相互作用，而且它们很易变。她目前在加利福尼亚大学洛杉矶分校，主持自己的干细胞生物实验室。“我们可能还需要进行更多优化，以确保发现特定肿瘤中可能存在的所有异质性。”她说。
宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学中心（University of Pittsburgh Medical Center）的神经肿瘤学家Jeremy Rich认为，与常规细胞培养相比，类器官具有不同的营养和生长要求，这使其难以用于高通量的研究。他的团队通过生物打印——一种类似于3D打印的过程，细胞和培养基代替了惰性材料——研究炎症和免疫系统如何促进胶质母细胞瘤的细胞行为。免疫功能障碍是许多癌症的一个关键因素，但这很难在类器官和动物模型中进行研究：前者没有免疫系统，而后者则是人为设计的免疫力受损的动物，以便人类肿瘤细胞可以在其中生长。
Rich和同事们使用不同细胞类型和透明质酸等前体材料混合来打印水凝胶。在打印的时候，水凝胶生长培养基形成一个3D支架，并接种可用作肿瘤模型的细胞。当Rich和他的团队尝试将胶质母细胞瘤干细胞与不同组合的其他神经细胞混合使用时，他们发现，在免疫细胞（巨噬细胞）存在的情况下，肿瘤细胞表达与促进胶质母细胞瘤病人肿瘤侵袭和耐药相关的基因[2]。他们还发现，在有其它类型细胞存在的情况下，干细胞更接近它们在现实中的行为，这表明组织环境在对干细胞的行为特征发挥了影响。
来自胶质母细胞瘤(一种侵袭性脑肿瘤)的癌细胞。图片来源：Steve Gschmeissner/ SPL
同样，法国巴黎居里研究所（Curie Institute）的细胞生物学家Silvia Fre发现，在成年健康小鼠的乳腺组织包含的干细胞是已分化的，不能形成肿瘤，但如果将这些细胞从组织中取出，它们将迅速重新激活多能性或者分化为包括癌细胞在内的不同类型细胞的能力，这凸显了组织环境在肿瘤发展中的关键作用[3]。
更简单的培养模型也可能具有启发性。Vermeulen和同事们在2018年的一项研究中[4]，使用了被称之为球体培养的简单模型系统（人肿瘤细胞在自由漂浮的三维培养系统中生长）和肿瘤异种移植（将肿瘤细胞接种于免疫缺陷小鼠体内，使其生长成为肿瘤）。通过这些研究方法发现，人类结肠癌细胞越靠近肿瘤边缘就越具有干细胞特征。当研究小组将肿瘤中心的非增殖细胞取出并移植到边缘时，这些细胞便表达了增殖标志物。作者总结道，决定人结肠癌干细胞的不是其内在的基因表达模式，而是其所在的位置。Vermeulen说：“发现肿瘤环境是决定干细胞的主导因素，我非常惊讶。哪些细胞的行为与干细胞相似，是一直在变化的，这取决于这些细胞在肿瘤中的位置。”
捕获细胞轨迹
环境和细胞特性的相互作用意味着癌细胞可能在某些实验条件下看起来像干细胞，而在其它条件下则不然，或因邻近细胞的不同而表达不同的基因。癌细胞还缺乏通用的表面标志，使得标记和研究它们变得更加棘手，但研究人员设计了一系列替代策略来追踪细胞的轨迹，其中许多是从发育生物学的工具箱中借用而来。
为了研究胚胎乳腺中的干细胞，Fre和她的团队使用了一种名为Confetti的小鼠（因这种小鼠的细胞可以表达四种不同的荧光报告基因而得名）。当研究人员在小鼠发育过程中的不同时间点用一种化学物质处理动物以诱导报告蛋白表达时，这些蛋白表达在不同的位置被激活，通过荧光显微镜可以观察到不同谱系的细胞在成体组织中的最终分布。在细胞培养研究中，Vermeulen及其同事们也使用了类似的基于荧光的方法来了解环境如何影响结肠癌干细胞的[5]。
当细胞发生突变并分化为不同的亚群时，遗传条形码是跟踪细胞的另一种选择。该方法为每个细胞群体提供固定的遗传条形码，该条形码随着细胞的分裂而不断发展。通过对细胞中的所有条形码进行测序并进行比较，研究人员可以得出不同细胞之间的相互关系以及它们对肿瘤生长的相关作用。
早期，这类方法依赖于用慢病毒将携带的静态条形码序列随机插入至一个细胞库，而现在，基于基因编辑工具CRISPR正在优化这一过程。
在基于CRISPR的谱系追踪中，研究人员将一系列CRISPR靶序列插入细胞的基因组中，Cas9酶周期性的切割这些靶序列，触发DNA修复过程，并留下基因疤痕，作为细胞及其后代的唯一标识。与慢病毒条形码不同，该系统在每次细胞分裂时都可生成唯一的动态条形码，从而使研究人员能够重建不同细胞及其子代细胞之间的相关性[6]。荷兰乌得勒支Hubrecht研究所（Hubrecht Institute）的干细胞生物学家Alexander van Oudenaarden说：“随着时间的推移，变化是不断累积的，这与之前使用的慢病毒条形码有根本上的区别。”
另一种方法是将荧光蛋白序列与DNA重复序列（胞嘧啶和腺嘌呤碱基长重复序列）结合，在分裂的过程中，细胞会周期性地修剪荧光蛋白序列以“修复”这些看起来出了问题的重复序列，最终使得使荧光蛋白序列被移动进入基因组中可以表达的位置。Vermeulen说，这种修复大约在每10000个细胞中发生一次，并产生在显微镜下可见的微小遗传光斑。这种荧光标记方法的优点是不需要化学物质激活，他说，“这是一种细胞完全不受干扰的谱系追踪方法。”
这些追踪策略都有其优缺点。例如，某些CRISPR序列比其他CRISPR序列更容易产生疤痕，在理论上无偏的过程中引入了偏差。基于显微镜和测序的策略都需要高级的计算和技术技能。尽管如此，结合单细胞RNA测序技术，这些标记技术仍然提供了强大的工具来评估单个细胞在肿瘤中的相对重要性。
Vermeulen指出：“如果肿瘤是由癌症干细胞驱动的，那么只有少数标记细胞会增殖并成为大型的克隆。但是在依赖于多种类型细胞的肿瘤中，大多数细胞都会扩增。把数据放到数学模型中，就能确定两种扩增模式的差异。”
成倍增加的检测
这些模型可以提供有关肿瘤细胞如何生长和变化的更完整的信息，但是它们需要新的计算方法。传统上用来推断细胞间系统发育关系的模型无法处理谱系追踪数据与单细胞RNA测序数据结合产生的大量信息。
西雅图华盛顿大学（University of Washington）的遗传学家Jay Shendure认为，这是发育生物学家长期以来一直在努力解决的问题。最早能同步进行谱系追踪和RNA测序的CRISPR系统之一就是由Jay Shendure团队所开发[7]。
在癌症研究中进行谱系追踪时，最大的问题还是技术：检测到足够数量的遗传条形码，并处理丢失数据。因为某些细胞群消失，或样品中遗传条形码序列的数量太少而无法处理，导致谱系追踪研究常常存在空位。Shendure认为，算法很难解决这些空位的问题，因此最大化编码遗传条形码的RNA序列的产量和稳定性至关重要。他说：“你需要相对较高的检出效率，例如，在一个研究中使用了X个细胞，你希望能够检测追踪到其中大部分的遗传条形码。”
在今年发表的一项研究中[8]，UCSF癌症研究人员Trever Bivona和他的同事对被移植到动物体内的肺癌细胞同时进行了谱系追踪和RNA表达水平变化的研究。基于Cas9工具，他们能够实时跟踪遗传变化是如何驱动癌细胞向远端组织播撒肿瘤细胞——即肿瘤的转移过程。
该研究小组从动物体内的6个不同位置获取了40000多个小鼠细胞的谱系和基因表达数据，并发现在明确进入到不同分化路径之前，细胞在不同的基因状态间多次往复。
为了分析这大量的数据，Bivona的合作者——马萨诸塞州剑桥怀特黑德研究所（Whitehead Institute in Cambridge）的生物学家Jonathan Weissman和加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）的计算机科学家Nir Yosef——开发了一套名为Cassiopeia的工具，以帮助在CRISPR-Cas9遗传条码数据的基础上重建细胞谱系[9]。其他研究人员可免费获取他们和其他团队的分析工具（请参阅 go.nature.com/2ptezwd）。
Bhaduri经常使用由统计学家Rahul Satija和计算生物学家Aviv Regev对Bhaduri来说，她常用的是Seurat工具箱[10]。Seurat由统计学家Rahul Satija和计算生物学家Aviv Regev在哈佛和麻省理工的布罗德研究所开发，能够同时分析基因表达改变以及单个细胞中特定基因的拷贝数的变化。
无论研究人员选择哪种工具集，Bhaduri都建议这类分析的新手依靠教程并学完算法开发人员提供的课程。而那些独立开发内部分析软件的人，例如Vermeulen等，则通常与生物统计学家合作。
当然，人们仍然需要更好的工具，Shendure说。“随着系统发育树中细胞数量的增加，可能的排列数量也成倍增加，因此我们将需要更丰富的工具，才能充分认识到到这一研究方向的潜力。”
仍然很复杂
从发育生物学的视角看癌症干细胞的问题，已经开始揭示驱动癌症的许多复杂因素，以及细胞形成肿瘤的多种途径。Rich说：“通过干细胞角度观察癌症，确实改变了人们对癌症的理解能力。”
该领域仍然缺乏对癌症干细胞的明确定义，但也许不需要那么明确。认识到干细胞样特性在肿瘤中的重要性，以及细胞微环境如何促进它们获得这些特性，就可能足以导向新的疗法。
某些特征为癌细胞和胚胎组织所共有，例如胶质母细胞瘤干细胞的快速移动行为和乳腺癌干细胞的多能性。健康成人组织缺乏这些特征，阻断癌细胞这些行为的疗法将不伤害正常细胞，所以这些特征可能成为理想的药物靶点。而阻断这些行为是这些研究的终极目标，无论这些行为是否由肿瘤干细胞所表现。
“截至目前，我们还没在癌症疗法上真正取得过有力成果，表明如果以肿瘤干细胞为靶点能延长患者生存期”，Rich说，“这是缺失的一环。”
参考文献：
1. Bhaduri, A. et al. Cell Stem Cell26, 48–63 (2020).
2. Tang, M. et al. Cell Res.30, 833–853 (2020).
3. Lilja, A. M. et al. Nature Cell Biol.20, 677–687 (2018).
4. Lenos, K. J. et al. Nature Cell Biol.20, 1193–1202 (2018).
5. Vermeulen, L. et al. Nature Cell Biol.12, 468–476 (2010).
6. Kester, L. & van Oudenaarden, A. Cell Stem Cell 23, 166–179 (2018).
7. Raj, B. et al. Nature Biotechnol. 36, 442–450 (2018).
8. Quinn, J. J. et al. Science371, eabc1944 (2021).
9. Jones, M. G. et al. Genome Biol. 21, 92 (2020).
10. Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F. & Regev, A. Nature Biotechnol. 33, 495–502 (2015).
原文以Elusive cancer cells dissected using developmental-biology toolkit标题发表在2021年4月20日的《自然》的技术特写版块上