转移性结直肠癌免疫治疗进展
近年来，肿瘤免疫治疗特别是免疫靶向药物在恶性肿瘤治疗方面显示出振奋人心的效果及巨大的潜能。转移性结直肠癌(mCRC)患者也从免疫治疗中看到新希望，尤其是在有错配修复功能缺陷(dMMR)的mCRC患者中，免疫检查点阻滞(CPI)治疗(抗PD-1药物单药治疗)可以获得40%的客观反应率(ORR)，临床获益率高达78%。并且，免疫治疗间联合或与传统放化疗等联合对mCRC也显示出较好的疗效。虽然免疫治疗前景乐观，但是仍然面临诸多问题，如很多动物实验中证实有效的方法在临床试验中却无效；仅有部分肿瘤患者对免疫治疗有反应，例如无错配修复功能缺陷(pMMR)mCRC患者对抗PD-1的治疗反应不佳；此外，免疫治疗疗效预测及评估标准仍有待研究等。本文主要就mCRC免疫治疗进展、疗效评估及疗效预测几方面进行论述。
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1mCRC免疫治疗进展
1.1 疫苗治疗
肿瘤疫苗治疗原理是含肿瘤抗原基因或肿瘤抗原肽的疫苗，通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力。转移性结直肠癌的研究中主要有肽疫苗、肿瘤细胞疫苗和树突状细胞疫苗等。作为mCRC肽疫苗的靶向肿瘤抗原包括癌胚抗原、p53蛋白、癌-睾丸抗原等。目前，肿瘤疫苗治疗仍处于动物研究及临床试验阶段，有效的疫苗治疗方法仍有待进一步研发和验证，随着新的疫苗制备技术和对肿瘤免疫的不断探索，肿瘤疫苗治疗可能会为mCRC患者带来更多临床获益。
1.2免疫细胞治疗
免疫细胞治疗需先从患者肿瘤组织或血液中分离出相关的淋巴细胞，经体外改造、细胞因子激活和扩增并回输，达到杀伤肿瘤细胞的目的。主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗、细胞毒性T细胞(CTL)治疗、经基因修饰的T细胞受体治疗(TCR-T)、嵌合抗原受体治疗(CAR-T)、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)治疗、细胞因子介导的杀伤细胞(CIK)治疗和树突状细胞诱导的杀伤细胞(DC-CIK)治疗等。
最近备受争议的CIK和DC-CIK等免疫细胞治疗虽然不能特异性识别肿瘤细胞相关抗原以特异性杀伤肿瘤细胞，然而Zhao等进行的Ⅱ期临床研究发现，一线行CIK联合FOLFOX4(奥沙利铂+氟尿嘧啶+叶酸)化疗的61例mCRC患者中位OS达36个月，中位无进展生存期(PFS)达16个月；对比单纯化疗的61例mCRC患者16个月的OS和10个月的PFS仍看到些许临床获益。说明CIK和DC-CIK在肿瘤治疗中可能有较好疗效，但这需要更多临床试验验证。但是，相关研究较为零散，病例数有限，往往难以做到严格的前瞻性、双盲和随机，其临床价值仍需要更多的临床试验来验证。此外，我国在曹雪涛教授牵头下对既往的DC-CIK治疗进行改进，将患者自身肿瘤抗原负载DC细胞，进而能更有效地诱导机体特异性免疫应答，并联合mFOLFOX化疗方案(奥沙利铂+氟尿嘧啶+叶酸)治疗晚期结直肠癌的Ⅱ期随机对照临床研究，主要终点客观缓解率也获得阳性结果，初步数据显示，DC+CIK联合化疗组疾病缓解率达45.1%(32/71)，而单纯化疗组为25.4%(18/71)。
TCR-T是将针对肿瘤特异性抗原的受体导入T细胞中，再将这些经过基因修饰的T细胞回输给患者来治疗肿瘤。理想的靶抗原是选择性高表达于肿瘤组织而不表达于正常组织的肿瘤特异性抗原，但是此类抗原目前很难找到，故用肿瘤相关抗原替代。TCR-T相关的肿瘤相关抗原包括分化抗原(如CEA)、过表达抗原、癌-睾丸抗原和肿瘤突变产生的新抗原等。值得注意的是，癌-睾丸抗原是肿瘤相关抗原中较为特殊的一类，可在多种来源的肿瘤细胞表面表达，但在正常组织中仅限于睾丸和胚胎组织。同时，生殖细胞不表达HLA分子，并且血睾屏障的存在保护睾丸免受攻击，所以针对癌-睾丸抗原的细胞治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。New York esophageal squamous cell carcinoma 1(NY-ESO-1)是这类抗原研究的热点。其在恶性黑素瘤、滑膜肉瘤和食管癌等多种肿瘤中过表达，多项研究发现，其对肿瘤筛查、评估预后和治疗方面均表现出较大潜力。
但是，TCR-T具有一定的局限性:如其疗效决定于TCR和抗原的亲和力，若TCR低亲和力、肿瘤下调主要组织相容性复合体(MHC)表达将降低其疗效；人类白细胞抗原(HLA)等位基因的排列组合具有多样性，TCR-T要求针对每例患者改造T细胞，这将增加这项技术的推广难度；转染后T细胞的α和β亚基会错误地和自身TCR配对，不能识别抗原或错误识别。
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是指将能够识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞内活化基序借助铰链结构连接为一体，转染T淋巴细胞，赋予T淋巴细胞对肿瘤抗原的高亲和性和对肿瘤细胞特异性杀伤能力，被转染的T细胞在体外扩增后回输患者体内，T淋巴细胞发挥其特异性识别肿瘤并且杀伤肿瘤细胞。经肝动脉注射靶向CEA的CAR-T的Ⅰ期临床试验结果显示，CEA+的多发性肝转移的mCRC患者获得较好的临床效果。
总体来说，TCR-T和CAR-T治疗血液疾病表现出令人惊喜的疗效，但在实体瘤中疗效不尽如人意，除与其脱靶效应和细胞因子风暴等不良反应相关外，还可能与下列因素相关:(1)TCR-T和CAR-T细胞在实体瘤内存活时间有限；(2)靶抗原特异性欠佳，T细胞不能做到精确特异性杀伤肿瘤细胞；(3)TCR-T和CAR-T细胞难以精准到达肿瘤所在位置；(4)实体瘤微环境内存在抑制性免疫细胞及介质等。针对以上问题，目前已有多种解决方法，因此TCR-T和CAR-T在实体瘤中的应用值得期待，如设计针对双靶抗原的TCR-T或CAR-T、使T细胞表达促存活基因以及联用anti PD-1等。
1.3免疫检查点阻滞
T细胞表面有激活T细胞的受体，如cluster of differentiation 28(CD28)、OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)和CD27等，与抗原呈递细胞上相应配体结合后可以促进T细胞活化发挥抗肿瘤效应；T细胞表面同时还有抑制T细胞活化的受体，如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡受体1(PD-1)，称为免疫检查点，当其和抗原呈递细胞上相应的配体结合后，传递的信号能够抑制T细胞活化，导致T细胞增殖、分泌细胞因子以及杀伤肿瘤细胞的功能下调，以维持免疫的稳态。肿瘤细胞表面常可高表达抑制T细胞活化的配体以削弱T细胞对其杀伤清除能力，因此通过药物靶向结合肿瘤细胞上的这些配体或T细胞上的受体，T细胞活化抑制现象得以改善，使T细胞尽可能地发挥其抗肿瘤效应。
近年来，抗免疫检查点受体如CTLA-4和PD-1的治疗展示出较好的临床治疗效果。PD1有PD-L1和PD-L2这2种配体，阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用可增强T细胞应答反应并增强其抗肿瘤活性。有研究报道，mCRC患者对抗PD-1和抗PD-L1治疗并没有很好的反应。也有研究报道，PD-L1表达与CRC有较好的预后相关，PD-L1表达与肿瘤浸润的PD-1 CD8+T细胞数量正相关，且此种关联只出现在pMMRCRC患者中。
抗CTLA-4药物ipilimumab对黑色素瘤显示出较好疗效，但单药对mCRC无效；抗CTLA-4药物tremelimumab在mCRC上疗效类似。研究显示，ipilimumab与抗PD-1单抗nivolumab联用与nivolum-ab单药治疗mCRC比较，在MSI-H晚期CRC患者中，nivolumab 3mg/kg单药组ORR为25.5%(12/47)，而nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 1mg/kg联用组ORR为33.3%(9/27)；而在微卫星稳定的晚期CRC中，nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 1mg/kg治疗组ORR为0.0%，nivolumab 3mg/kg+ipilimumab 3mg/kg组ORR为10.0%(1/10)。与抗CTLA-4药物ipilimumab比较，靶向PD-1/PD-L1轴的药物最明显的区别是抗PD-1/PD-L1的阻断剂毒性更小。多数毒性可以通过支持治疗或类固醇类激素得到改善。但抗PD-1/PD-L1轴治疗仍存在其他问题，如仅有部分患者对其敏感。
除nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、ipilimumab和tremelimuma外，其余还有多种抗PD-1/PD-L1轴和抗CTLA-4药正在mCRC患者上进行临床试验。此外，其余多种靶向免疫调节受体的药物在mCRC中的应用也处于临床试验阶段，如抗淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白。
1.4其他免疫治疗
1.4.1免疫激动型抗体
T细胞表面有激活T细胞的受体，如CD28、OX40、GITR、4-1BB及CD27等，与抗原呈递细胞上相应配体结合后促T细胞活化发挥免疫效应。免疫激动型抗体多数是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族。目前mCRC治疗正处于临床试验阶段的包括靶向CD27、OX40、GITR、4-1BB及CD40的激动型抗体。
1.4.2免疫系统调节治疗
某些物质(包括细胞因子和某些生长因子)有助于调节免疫系统的活性，激活淋巴细胞，增强抗肿瘤免疫应答。目前白细胞介素和干扰素2种细胞因子已用于恶性肿瘤的治疗。将此类药物与其他免疫治疗方法联合可能产生更优的治疗效果。
1.4.3溶瘤病毒
溶瘤病毒是能特异性感染和裂解肿瘤细胞、并引起肿瘤部位免疫反应但不损伤正常细胞的特殊病毒。在一项Ⅰ期临床试验中，一线治疗失败的12例mCRC患者在化疗前经肝动脉给予溶瘤病毒NV1020治疗4周，所有患者均出现CEA水平下降，中位生存期为25个月，其中1例肿瘤体积缩小75%。另外，一项Ⅱ期临床试验表明，NEO-102(嵌合单克隆IgG1抗体)单药可改善mCRC的OS，且耐受良好，提示嵌合单克隆抗体可能有较好的抗肿瘤效果。
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免疫治疗疗效评估标准(irRC)
因为肿瘤免疫治疗独特的抗肿瘤机制，在临床上套用评价细胞毒药物疗效评价标准(如RECIST标准和WHO标准)可能会产生一些错误的判断。例如一些患者经免疫治疗后在临床上出现肿瘤增大或出现新病灶，按照RECIST标准或WHO标准会判断为肿瘤进展，但是病理检查后发现增大的病灶并不是肿瘤增殖所致，而是因为T细胞浸润引起的炎性反应，这些患者如果继续给予免疫治疗会使得肿瘤缩小。此外，免疫治疗不像化疗一样可以快速、显著地使肿瘤退缩，而是需要一定的时间起效，其疗效也未必能反映在肿瘤大小上，因此传统的RECIST标准和WHO标准不能精准、客观地反映其疗效。
2013年专家在RECIST标准的基础上提出irRC标准用于肿瘤免疫治疗的反应评估。irRC标准将可测量的新发病灶计入总肿瘤负荷，再对比每次总肿瘤负荷进行疗效评估，而传统RECIST或WHO标准则将新发病灶算为疾病进展。由于免疫治疗中出现新病灶很有可能是T细胞浸润肿瘤微环境引起的免疫反应，因此irRC更强调的是肿瘤总负荷情况而非新病灶。在免疫治疗期间发现疑似新病灶或肿瘤增大时，irRC要求临床医师评估间隔时间≥4周，但是既往研究发现，原先疑似进展的肿瘤3个月左右才在影像上出现稳定或改善并最终临床获益，因此4周时间可能太短，临床医师需要结合患者是否在治疗期间出现症状改善和体力状态改善等征象综合分析来判断免疫治疗是否对患者有益，从而决定是否继续免疫治疗。有研究者认为，对于疑似新病灶或肿瘤增大不能确定的病例，结合病理活检或许是个可行的办法。
此外，irRC联合其他量化指标也许能更好地帮助评估免疫治疗反应，如通过Hounsfield Unit检测CT上肿瘤密度减低程度。在一项用ipilimumab联合贝伐珠单抗治疗进展期黑色素瘤的研究中，经治疗1/3的患者CT检查显示，肿瘤密度减低≥15%，但是尚未能明确其与治疗反应的具体关系。同时，用影像学方法评估免疫治疗不良事件有待进一步研究。
已有学者研究分子影像技术在肿瘤免疫治疗中疗效评估的应用。肿瘤浸润淋巴细胞可能是预测免疫治疗反应的一个标志物，但是一般需要通过有创活检去检测，并且活检取材部位等可能影响肿瘤浸润淋巴细胞的检测结果。如果能通过分子影像方法去检测肿瘤浸润淋巴细胞，可获得全面的、无创的免疫反应评估，从而预测疗效。目前已有相应探针用于此种分子影像检查，如识别活化T细胞的探针、识别活化T细胞表面IL-2受体的探针等，还有靶向PD-L1、TGF-β和巨噬细胞的探针。
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预测CPI疗效的标志物
尽管免疫治疗展示出振奋人心的抗肿瘤效果，但是每种免疫治疗方法仅有部分患者有效，因此急需找到能够预测疗效的标志物。
3.1肿瘤微环境内淋巴浸润
早期研究表明，肿瘤微环境内高密度的CD3+CD8+CD45RO+颗粒酶+T细胞(即有抗原经验的溶细胞效应T细胞)与结直肠癌低复发风险和较长的OS相关；肿瘤微环境内免疫细胞密度的评估预后效能优于传统TNM分期。Kirilovsky等提出一个免疫评分:分别对肿瘤内部和侵犯边缘这2个区域的CD3+T细胞和CD8+T细胞进行计数，再根据计数计算出2种细胞在各区域的免疫密度，分为高密度和低密度；2个区域和2种密度组合形成I0～I4这4类分数。研究报道，用此免疫评分评估经中位5.9年随访的Ⅱ/Ⅲ期根治术后的结肠癌患者显示，评分低的患者肿瘤复发时间(TTR)短于评分高的患者。此外，Tumeh等发现，治疗前黑色素瘤肿瘤边缘CD8+T细胞密度与抗PD-1疗效相关。此评分系统或许可以用于预测免疫治疗疗效。
3.2微卫星不稳定(MSI)
人体内存在一套修复DNA碱基错配的系统，称之为DNA错配修复(MMR)系统。其对保持遗传物质的完整性、稳定性及避免遗传突变的产生具有重要作用。MSI是MMR缺失的结果，由于DNA重复单元的插入或缺失而导致的。MMR胚系突变最早是在Lynch综合征中发现，接着在散发性肿瘤包括结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、十二指肠癌及前列腺癌中发现MMR基因体细胞突变。
虽然整体CRC患者对抗PD-1治疗不敏感，但标准治疗失败的mCRC患者，如为dMMR患者，单药pembrolizumab治疗可以产生40.0%(4/10)的客观反应率和77.8%(7/9)的疾病缓解率；而pMMR患者0例获得CR或者PR的疗效。在同一研究中单药pembrolizumab治疗给dMMR非CRC患者带来71.4%(5/7)的ORR和66.7%(4/6)的临床获益率，说明pembrolizumab治疗的疗效与肿瘤类型关系不大，而主要与肿瘤的MSI状态有关。与mic-rosatellite instability low(MSI-L)结直肠癌比较，MSI-H结直肠癌的肿瘤微环境内有大量T细胞(尤其是CD8+T细胞)浸润，浸润性CD4+T细胞向T辅助细胞表型倾斜，而CD8+T细胞是发挥细胞毒性的主要细胞，攻击肿瘤细胞。并且，MSI-H肿瘤高水平表达大量免疫检查点分子，包括PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG3；也高表达IDO1，而PD-L1高表达提示对免疫检查点阻滞剂(CPI)治疗敏感。此外，MMR功能的缺失可引起大量基因突变，全基因组测序发现，每个dMMR肿瘤细胞平均有1 782个突变，而pMMR肿瘤细胞只有73个突变，突变产生新抗原，引发大量T细胞反应，而抗PD-1治疗可促进T细胞杀伤肿瘤细胞。以上3点可能是MSI CRC对抗PD-1治疗敏感的原因。3.3基因突变总负荷
基因突变、重排、插入及缺失均可编码产生肿瘤特异性新抗原，并且只需单个DNA改变就能产生多种可能被T细胞识别的表位。突变总负荷越大的肿瘤可能产生越多新抗原，因此肿瘤会被大量的肿瘤特异性T细胞攻击。抗PD-1治疗可以使抗肿瘤T细胞反应得以更充分的发挥，因此有更高突变负荷的肿瘤(与是否为致癌突变无关)对抗PD-1可能更敏感。
有限的研究已经显示，突变总负荷越大的肿瘤对CPI越敏感。黑色素瘤、NSCLC、Lynch综合征、膀胱癌和胃癌等有很高突变负荷的肿瘤对抗PD-1或抗PD-L1反应更佳。吸烟相关肺癌的突变负荷较非吸烟相关肺癌明显增高，因此吸烟NSCLC患者对抗PD-1有更好的反应。而像胰腺癌、前列腺癌和非MSI-H的CRC，这些突变负荷较低的肿瘤对抗PD-1/PD-L1途径的治疗反应较差。目前没有明确的截断值来划分高突变负荷和低突变负荷肿瘤。临床上也有总突变负荷很高的患者对抗PD-1不敏感，而低突变负荷患者对抗PD-1敏感，因此目前尚不能将此作为排除患者接受CPI治疗的标志物。
3.4肿瘤微环境内PD-L1的表达水平
在一些肿瘤中，PD-L1表达继发于信号通路突变或染色体变化，其中基因突变总负荷比单个致癌驱动基因突变有更大的作用，在如黑色素瘤和吸烟相关肺癌这些癌基因驱动型肿瘤以及DNA损伤修复功能缺失的肿瘤中这一现象更为明显。而在非Lynch综合征的结直肠癌和胃癌等肿瘤中，肿瘤浸润性免疫细胞中几乎没有PD-L1的表达，肿瘤细胞也很少表达PD-L1。此外，多种细胞如肿瘤细胞、活化的淋巴细胞和肿瘤相关巨噬细胞等都可在细胞质或细胞表面表达PD-L1，这对免疫抑制的作用尚不明。还需注意的是，很多参与抗PD-1临床试验的患者已接受过多种治疗，这也许会改变PD-L1的表达水平。
多种肿瘤患者肿瘤内PD-L1表达提示较好的预后，如在CRC中，PD-L1高表达与pMMR、较早T分期、无淋巴结转移、肿瘤低分化、无血管浸润和较好的预后相关。这有悖于PD-L1的免疫抑制作用。这一现象的原因可能是:当肿瘤浸润细胞毒性T细胞遇到抗原时PD-1表达上调并分泌干扰素γ(IFN-γ)，IFN-γ是CD8+T细胞辅助1的细胞因子，接着针对IFN-γ出现适应性免疫反应，附近的肿瘤细胞和浸润性免疫细胞PD-L1表达上调。这种诱导PD-L1产生方式使这些细胞免受活化的PD-1+效应T细胞的攻击。因此，PD-L1的表达可以看作是细胞毒性T细胞被激活开始抗肿瘤的标志。
多项研究提示，PD-L1水平较高的肿瘤患者对抗PD-1—PD-L1轴治疗反应更好。一项研究综合分析多项报道发现，15种实体瘤对抗PD-1治疗的平均反应率为29%，在PD-L1阳性肿瘤中平均反应率提高至48%，而PD-L1阴性肿瘤中仅为15%。虽然PD-L1表达与抗PD-1治疗的长期疗效如PFS和OS的相关性尚未明确，一些研究提示，PD-L1高表达预示更长的生存期。对于那些有多种可选择治疗方案的患者来说，PD-L1阳性患者可以考虑将抗PD-1—PD-L1轴治疗作为一线治疗，而PD-L1阴性患者可以考虑将抗PD-1—PD-L1轴治疗作为二线及后续治疗。
此外，还有研究发现，多个标志物联合应用，如联合PD-L1表达水平、CD8+T细胞密度和IFN-γ通路相关标志物可以有更好的预测价值。有趣的是，与PD-L1表达水平比较，淋巴细胞表达PD-1(抗PD-1治疗的直接靶目标)似乎没有更好的预测价值。目前，PD-L2的表达对于预测肿瘤预后及抗PD-1的疗效未明。
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总 结
mCRC患者并不是肿瘤免疫治疗中获益最大的人群，但其应用前景值得期待。曹雪涛教授牵头的DC-CIK联合化疗对比单纯化疗治疗mCRC的Ⅱb/Ⅲ期全国多中心临床研究正在进行中，TCR免疫细胞治疗也值得期待，MSI-H患者接受抗PD-1单药治疗的临床经验正在积累之中。但是也有很多问题尚待明确和进一步研究，如抗PD-1和抗CTLA-4药物有无协同作用，CPI治疗与传统化疗、抗EGFR和抗VEGF靶向药物如何合作，如何精准评价免疫治疗的疗效以及如何从分子检测去预测或筛选有效患者。