《科学》：用看星星的方式看肿瘤！霍普金斯大学科学家用天文成像分析技术研究肿瘤切片，找到预测免疫治疗疗...
“天文学“和“观星”对大家而言或许是遥远浪漫的事。
而近日，约翰霍普金斯大学Janis M. Taube领衔的研究团队在《科学》杂志的发文[1]，则一举展示了什么叫做“不懂浪漫的肿瘤成像学不是好研究”～
他们借助天文成像分析技术开发了一个分析肿瘤切片的平台AstroPath。用AstroPath对接受PD-1抑制剂的98位黑色素瘤病人进行了肿瘤切片分析，发现了两种与PD-1抑制剂应答显著相关的肿瘤侵润免疫细胞：CD163 PD-L1- 髓细胞 （无应答）和 CD8 FoxP3 PD1low/mid T细胞（应答）。
值得一提的是，他们还通过合并AstroPath找到的多种细胞表型，实现了在独立验证样本群中对患者存活率（OS，PFS）的预测。
论文首页截图
由于免疫检查点抑制剂（ICI）在不同肿瘤的临床应用中只有一小部分患者获益，因此临床上急需更好的生物标志物帮助筛选出受益人群[2]。
单色免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）使临床病理检测在几十年间取得了巨大的进步，但在预测ICI治疗效果方面还存在着许多不足。其中主要原因是，免疫治疗应答涉及肿瘤内、微环境内和全身的众多细胞，以及它们之间的相互作用，单一的标志物往往不足以概括这其中的复杂关系。比如PD-L1作为获得FDA批准的ICI生物标志物，依然无法准确的预测免疫疗法应答[3]。
多色免疫组化（mIHC）和免疫荧光染色（mIF）提供了可以呈现和分析多种免疫相关因子的方法（如观测肿瘤侵润免疫细胞的表型），是在ICI标志物研究中一直被看好的技术。
一篇发表于2019年的系统评价和meta分析指出，在近几年PD-1/PD-L1抑制剂生物标志物的研究中，相较于IHC和肿瘤突变负荷，mIF/mIHC 测量对免疫应答有更高的预测准确度[4]。
遗憾的是，虽然用mIF研究肿瘤微环境（TME）的研究非常多，但是mIF一直没能确定一种可标准化的标志物。这或许是因为mIF在图像分析和大量数据处理方面面临着很多挑战；尤其是在分析面积较大的肿瘤切片时，往往需要研究者进行选区分析，但这会影响对TME细胞组成测量的全面性。
Janis M. Taube团队意识到，用天文望远镜观测的星系和用显微镜观察的细胞在成像分析上非常相似，于是他们大胆借鉴了用于分析 1022 米尺度星系的图像分割经验，对在 10-6 米尺度上的肿瘤病理图像分析进行了改革。
天文学的银河系识别和病理学的肿瘤切片细胞识别有着相通之处
由此建立的AstroPath 平台不仅解决了肿瘤成像分析中许多常见问题，还通过将mIF和其分析流程标准化，推进了这项技术在ICI疗法的标志物发现和临床筛选中的应用。
Janis M. Taube团队意识到，如果想通过mIF实现对TME更精准的评估，就不能像以往的肿瘤成像研究那样将标志物表达分为阳性或阴性。
于是他们首先对测量参数的可靠性进行了优化，重点解决了荧光信号的强度不稳定，对分子表达于哪种细胞的鉴定不准确（切片有相邻或重叠细胞，相邻荧光通道的信号“溢出”造成的信号重叠），以及显微镜亮度变化和透镜畸对原位置信号测量的影响等问题。
研究人员通过反复试验，将这些问题一一击破。例如，对于荧光强度低，无法准确检测到有PD-L1low表型的细胞，就使用酪酰胺信号放大（TSA-based）技术，并且逐一调整一抗和荧光基团的稀释度，确保每个标志物在mIF中的检测值与IHC显色检测（chromogenic IHC）相符。最终设计出了mIF六重标记物检测组合（PD-1, PD-L1, CD163, FoxP3, CD8, Sox10/S100）。
Astropath在本文中使用的mIF六重检测组合在信号表达上与IHC显色检测相符
在图像采集上，不完全平场校正（incomplete flat-fielding）会造成荧光强度变化，而拼接错误也会造成高倍视野区（HPF）的错位，这些问题会直接影响4-5% 的细胞分析结果。
作者借鉴了天文观测中的经验，在每个HPF之间保留了20%的重叠图像，并用类似于光学防抖原理的“弹簧模型“把像素偏移最小化。
（B）白色为图像重叠部分（C）弹簧模型采取了以一个点为基准调整偏移像素
除此以外，作者还对分析细胞表型进行了多次程序优化，解决了mIF成像分析中常见的细胞分割问题。如会把单个较大细胞（例如癌细胞，髓细胞）进行多次分割，从而记录为多个。
对于优化后的程序，作者也进行了多重把控来保证结果的准确性和可复制性。比如从每个样本中抽取～25000个细胞进行验证，以及对照正常组织表达（微阵列）进行校准。这些把控大大减少了mIF研究中常见的批次效应（batch effect），提高了AstroPath的实用性。
AstroPath通过程序优化解决了细胞分割和表型预测上的问题
通过对AstroPath的成功运用，作者在黑色素瘤的肿瘤微环境里找到了CD8 FoxP3 表型的T细胞（在肿瘤微环境T细胞里仅占比～3%的稀有亚型），且结合这些T细胞集中于肿瘤边缘的位置，判断出它们可能是处于致敏早期的肿瘤反应性T细胞。
肿瘤细胞和不同T细胞亚型在黑色素瘤微环境里的位置分布
接下来，作者将AstroPath测量的肿瘤PD-L1表达和传统病理方法（用IHC进行人工评分）进行了对比。AstroPath mIF测量的PD-L1表达和 PD-L1 肿瘤细胞密度都与ICI应答成正相关，而传统方法则没能预测ICI应答。
mIF会产生大量的图像数据，在一般实验或临床应用中很难做到对整个切片进行采集和分析。人工选取HPF则会带来选择性偏差，并无法全面分析肿瘤微环境里的细胞多样性。于是作者又把目光转回了在生成大型多光谱数据集方面有着丰富经验的天文学研究。
在观测广袤的宇宙时，星系可能只是微小的噪点，想确定它们的位置则需要增强信噪比。据此，科研人员们设计出了CD8“热点”筛选法：根据 CD8 T 细胞的密度对 HPF 进行排名，首先选择密度最高的，以此找出肿瘤微环境中免疫激活度最高的地方。他们把用热点发筛选出的HPF，和随机抽取的HPF进行了标志物测量的对比。
通过热点筛选法，作者得出CD8 FoxP3 PD-1low/mid T细胞密度和ICI应答成正相关；在仅选取～10-30% 的总切片面积时，曲线下面积（AUC）就能达到74%。而在使用随机法筛选出的HPF分析中，T细胞肿瘤侵润和ICI应答没有显著相关性。
PD-L1-表型的巨噬细胞 (CD163 PD-L1-) 和癌细胞则与ICI应答成负相关 ，在热点或随机法选取～30-50%的总切片面积时，AUC达到73-76%。
不同细胞亚型对ICI应答的预测程度
用“热点法”筛选出整个切片30%的HPF之后，研究者通过单变量分析发现了十个与ICI应答相关的特征（P < 0.05）；逻辑回归分析在原有样本里达到了92% AUC的预测率，在验证样本中也高达88%。
mIF检测出多个因素与ICI应答相关；通过逻辑回归分析，多因素mIF检测在两组独立的黑色素瘤样本中都达到了很高的应答预测
最后，研究者们将患者分为三组进行了生存分析：
- 免疫反应较差：在三个负相关特征里的至少一种有着最高细胞密度
- 免疫反应较好：在七个正相关特征里的至少一种有着最高细胞密度
- 免疫反应中等：以上两种都不是/十个相关特征的细胞密度水平都处于中等
三组免疫表型在验证样本的Kaplan Meier分析中对总生存期和无进展生存期都做到了准确的预测（OS P = 0.036；PFS P = 0.024）。
（C）三组患者在mIF肿瘤成像中的表达区别（D）Kaplan-Meier生存分析
Taube团队的这篇论文首次通过将mIF的流程标准化推进了mIF在发现生物标志物和临床预测中的应用。
仅用六种荧光标记，AstroPath平台就实现了黑色素瘤ICI标志物发现和患者生存预测。他们还表示，未来可以尝试减少标记数量而增强mIF在临床上的实用性，或尝试其他免疫调节标记物来进一步分析对免疫疗法产生耐药性的肿瘤微环境。
未来，这种半自动化数据处理，减少人为干预的研究思路，或许可以进一步在多光谱组织成像学和细胞学中得到发挥。
参考文献：
[1].Berry S, Giraldo NA, Green BF, et al. Analysis of multispectral imaging with the AstroPath platform informs efficacy of PD-1 blockade. Science. 2021;372(6547):eaba2609. doi:10.1126/science.aba2609
[2]. Sunshine J, Taube JM. PD-1/PD-L1 inhibitors. Curr Opin Pharmacol. 2015;23:32-38. doi:10.1016/j.coph.2015.05.011
[3]. Taube JM, Galon J, Sholl LM, et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Mod Pathol. 2018;31(2):214-234. doi:10.1038/modpathol.2017.156
[4]. Lu S, Stein JE, Rimm DL, et al. Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019;5(8):1195-1204. doi:10.1001/jamaoncol.2019.1549
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