什么，你需要1T内存！！！

最近接了一个61个10x的单细胞转录组样品项目，使用以前的流程，自动进行质量控制，降维聚类分群，本来应该是分分钟的事情，但是在一个步骤居然卡死了，我看了的这个函数，doubletFinder_v3 ，是去除单细胞转录组里面的双细胞作用，报错如下所示：

> sce.all.filt <- doubletFinder_v3(sce.all.filt, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp, PCs = 1:10)
Loading required package: fields
Loading required package: spam
Loading required package: dotCall64
Loading required package: grid
Spam version 2.6-0 (2020-12-14) is loaded. 
KernSmooth 2.23 loaded
Copyright M. P. Wand 1997-2009
[1] "Creating 96208 artificial doublets..."
[1] "Creating Seurat object..."
[1] "Normalizing Seurat object..."
Performing log-normalization
0%   10   20   30   40   50   60   70   80   90   100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
[1] "Finding variable genes..."
Calculating gene variances
0%   10   20   30   40   50   60   70   80   90   100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
Calculating feature variances of standardized and clipped values
0%   10   20   30   40   50   60   70   80   90   100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
[1] "Scaling data..."
Centering and scaling data matrix
  |=========================================================| 100%
[1] "Running PCA..."
[1] "Calculating PC distance matrix..."
Error: cannot allocate vector of size 1103.4 Gb
> 


原来是因为我把 61 个10X单细胞转录组样品项目的全部单细胞数据合并后，细胞数量太多了，一次性走doubletFinder_v3 函数，超出了它的限制。

也就是说，先合并样品，再走doubletFinder_v3 ，连我的服务器也无法hold住，所以我先把61 个10X单细胞转录组样品拆分开来，然后每个10x样品自己独立走doubletFinder_v3 函数，代码如下：


#拆分为 个seurat子对象
sce.all.list <- SplitObject(sce.all, split.by = "orig.ident")
sce.all.list

library(DoubletFinder)
#sce.all.filt=sce.all.list[[1]]
phe_lt <- lapply(names(sce.all.list), function(x){
  sce.all.filt=sce.all.list[[x]]
  sce.all.filt = FindVariableFeatures(sce.all.filt)
  sce.all.filt = ScaleData(sce.all.filt, 
                           vars.to.regress = c("nFeature_RNA", "percent_mito"))
  sce.all.filt = RunPCA(sce.all.filt, npcs = 20)
  sce.all.filt = RunTSNE(sce.all.filt, npcs = 20)
  sce.all.filt = RunUMAP(sce.all.filt, dims = 1:10)

nExp <- round(ncol(sce.all.filt) * 0.04)  # expect 4% doublets
  sce.all.filt <- doubletFinder_v3(sce.all.filt, 
                                   pN = 0.25, pK = 0.09, 
                                   nExp = nExp, PCs = 1:10)
  
  # name of the DF prediction can change, so extract the correct column name.
  DF.name = colnames([e-mail])[grepl("DF.classification", 
                                                   colnames([e-mail]))]
  p5.dimplot=cowplot::plot_grid(ncol = 2, DimPlot(sce.all.filt, group.by = "orig.ident") + NoAxes(), 
                                DimPlot(sce.all.filt, group.by = DF.name) + NoAxes())
  p5.dimplot
  ggsave(filename=paste0("doublet_dimplot_",x,".png"),
         plot=p5.dimplot)
  
  p5.vlnplot=VlnPlot(sce.all.filt, features = "nFeature_RNA", 
                     group.by = DF.name, pt.size = 0.1)
  p5.vlnplot
  ggsave(paste0("doublet_vlnplot_",x,".png"),
         plot=p5.vlnplot)
  print(table([e-mail][, DF.name] ))
  #过滤doublet
  phe=[e-mail]
  phe
})


虽然是运行了一天一夜才完成。有了结果，就可以去除双细胞啦，代码如下：

kpCells=unlist(lapply(phe_lt, function(x){
  #table(x[,ncol(x)])
  rownames(x[ x[,ncol(x)]=='Singlet', ])
}))
kp = colnames(sce.all) %in% kpCells
table(kp)
sce=sce.all[,kp]


这样我还是拿到了最终的 sce 对象，后续分析就没有什么问题了！如下所示的一个简单的降维聚类分群图：