科研| SCI TOTAL ENVIRON：暴露于环境细颗粒物对肥胖小鼠模型心脏的影响（国人佳作）
编译：文文，编辑：谢衣、江舜尧。
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暴露于细颗粒物（PM2.5）与心脏功能下降有关，尤其是在肥胖等高风险人群中。本研究采用饮食诱发的肥胖小鼠模型研究PM2.5对心脏功能的影响。结果表明了PM2.5对心脏功能的直接影响和对其他器官损伤都的间接影响。肺和下丘脑发炎可能是血清苯丙氨酸代谢物及其下游产物肾上腺素和去甲肾上腺素，参与调节心脏系统的儿茶酚胺升高的原因。在心内系统中，除氧化应激和炎症外，高脂饮食（HFD）和PM2.5共同处理还导致能量代谢失衡。研究表明能量代谢异常可能是导致HFD和PM2.5共同处理更严重不良反应的重要因素之一。
论文ID
原名：Effects of exposure to ambient fine particulate matter on the heart of diet-induced obesity mouse model
译名：暴露于环境细颗粒物对饮食诱发的肥胖小鼠模型心脏的影响
期刊：Science of the total environment
IF：6.551
发表时间：2020.5
通讯作者：蔡宗苇
通讯作者单位：香港浸会大学
实验设计
C57BL/6J雄性小鼠接受普通饮食（ND）或高脂饮食（HFD）喂养4周，随后气管内滴加不含或含PM2.5（0.25 mg/kg/天）样品的磷酸盐缓冲液（PBS），持续4周。小鼠分组如下：不含PM2.5的PBS处理的ND喂养小鼠（ND-PBS）；含PM2.5的PBS处理的ND喂养小鼠（ND-PM2.5）；不含PM2.5的PBS处理的HFD喂养小鼠（HFD-PBS）；含PM2.5的PBS处理的HFD喂养小鼠（HFD-PM2.5）。每周检测一次小鼠体重和血糖水平。使用MiniTR无创血压分析仪连续监测和记录小鼠血压和心率。第八周结束时处死所有小鼠，收集血清和心脏用于进一步分析。H＆E染色对心脏进行组织病理学分析；实时定量PCR用于检测小鼠炎症，氧化应激和脂肪酸氧化相关基因的表达；ELISA试剂盒检测小鼠血清中多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素水平；血清代谢组学和心脏脂质组学用于探索HFD和PM2.5共同处理导致的分子水平的变化。
实验结果
1 PM2.5暴露会增加HFD诱导的肥胖小鼠的血压和心率，引起心脏炎症
为了检验肥胖个体更易受PM2.5感染的假设，在暴露期间，记录小鼠体重，血糖，心率和血压。与ND组（ND-PBS和ND-PM2.5）相比，HFD组（HFD-PM2.5和HFD-PBS）小鼠体重和血糖显著增加，表明成功建立了肥胖小鼠模型。但是在相同饮食下PM2.5暴露组和对照组之间没有观察到差异（图1a和b）。HFD-PM2.5组的心脏重量比ND-PM2.5组更大（图1c），并且心脏体重比值比HFD-PBS组更高（图1d），表明PM2.5和HFD共同处理可能会加速小鼠心脏生长。毒理学研究中，血压和心率是评估心脏系统状态的关键参数，较高的心率与心血管疾病死亡率或心源性猝死密切相关。PM2.5暴露四周会增加两种饮食喂养小鼠的心律（图1f），但仅在HFD喂养组中引起血压升高（图1e），表明HFD和PM2.5共同处理对心脏的影响更大。先前的报告发现肥胖和PM2.5暴露均与慢性炎症相关。但是，心脏切片的H＆E染色结果表明，单独使用任何一种处理方式都没有明显的组织学变化。相反，PM2.5和HFD共同处理导致HFD-PM2.5组小鼠心脏中的炎症细胞浸润，表明这两个危险因素对心血管系统具有协同作用。
2 PM2.5激活了HFD诱导的肥胖小鼠血清中苯丙氨酸代谢途径，以及心脏中泛酸和CoA生物合成途径
为了研究PM2.5和肥胖对心脏病的协同影响，采用代谢组学研究分别从血清和心脏中鉴定出43和37种代谢物。偏最小二乘判别分析得分图中四组彼此之间明显分开，特别是在心脏中，这表明处理对血清和心脏中的代谢物都有明显的影响。对鉴定出的代谢物进行KEGG通路分析，HFD喂养小鼠的血清和心脏中分别有2条和5条被PM2.5干扰的途径。共同处理影响血清和心脏中苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成途径。苯丙氨酸代谢仅在血清中被激活；而泛酸和CoA的生物合成，嘌呤代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢途径仅在心脏受到干扰。
苯丙氨酸是一种与心力衰竭密切相关的代谢物。血清代谢组学数据显示，除苯乳酸外，所有检测到的苯丙氨酸途径中的代谢物（包括酪氨酸，苯丙酮酸，2-苯乙酰胺和苯乙酰甘氨酸）均显著增加（图2a-f）。苯丙氨酸和酪氨酸是儿茶酚胺的前体，儿茶酚胺包括多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素，它们可以直接作用于心脏并在调节心血管系统和能量输出中起重要作用。ELISA测量血清中儿茶酚胺。HFD-PM2.5组中只有肾上腺素和去甲肾上腺素显著增加，表明PM2.5可能会改变肥胖小鼠中肾上腺素和去甲肾上腺素的释放（图2g–i）。
在心脏中，泛酸和CoA的生物合成，嘌呤代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢途径都受到HFD和PM2.5共同处理的影响。在泛酸和CoA生物合成途径中检测到的所有代谢物均增加（图3），表明HFD和PM2.5共同处理促进CoA合成，并且干扰能量代谢。PM2.5使肥胖小鼠心脏中嘌呤代谢中的代谢产物（如尿酸，黄嘌呤和鸟嘌呤）的含量显著增加。嘌呤代谢与氧化应激密切相关，尿酸升高被认为是氧化应激的标志物，嘌呤代谢中代谢产物的增加表明氧化应激可能发生在HFD诱导肥胖小鼠的心脏中。
3 靶向代谢组学研究表明PM2.5干扰HFD诱导的肥胖小鼠心脏的能量代谢
心脏是最需要能量的器官之一，心脏能量代谢的改变是导致许多心血管疾病的主要因素。靶向代谢组学研究线粒体氧化为心脏提供能量的两种最重要的物质：脂肪酸和葡萄糖（碳水化合物）。PM2.5和HFD均可导致总脂肪酸丰富增加，HFD-PM2.5组小鼠心脏和血清中增加的最大，表明两者的加性效应。大多数长链脂肪酸在PM2.5和HFD共同处理后增加（图4a和b）。作为脂肪酸的转运蛋白，共同处理的小鼠血清和心脏中的酰基肉碱水平下降（图4c和d）。尽管葡萄糖水平增加，但在PM2.5和HFD共同处理，其参与糖酵解和葡萄糖氧化的下游代谢产物却显著降低（图4e），表明共同处理可能对糖酵解具有抑制作用。为了进一步研究PM2.5和HFD共同处理对能量代谢的影响，我们还检查了二磷酸腺苷（ADP），三磷酸腺苷（ATP），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和乙酰辅酶A的水平，这是脂肪酸和葡萄糖氧化后进入三羧酸循环产生ATP的过程。结果表明，共处理降低了乙酰辅酶A和ATP的水平，增加了ADP（图4e）。共同处理还引起氧化剂FAD和NAD+升高。表明HFD和PM2.5共同处理干扰心脏的能量代谢。
4 PM2.5干扰HFD诱导的肥胖小鼠心脏的脂质代谢
过量的游离脂肪酸会转化为神经酰胺（Cer）和其他有毒脂质，在体内引起脂毒性。脂质组学研究PM2.5诱导的脂肪酸增加是否促进了HFD诱导的肥胖小鼠心脏的脂毒性。PM2.5和HFD共同处理引起小鼠心脏脂质代谢的改变。肥胖小鼠心脏中三类主要脂质（鞘脂，甘油糖脂和甘油磷脂）发生显著变化。PM2.5和HFD共同处理后，鞘磷脂，单酰基甘油，溶血磷脂酰，溶血磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇含量降低，而Cer，磷脂酰甘油（PG）和磷脂酸（PA）含量增加。此外，PM2.5处理的HFD诱导的肥胖小鼠中出现甘油三酯（TG）的积累。
5 PM2.5改变HFD诱导的肥胖小鼠炎症，氧化应激和脂肪酸氧化相关基因的表达
涂覆在PM2.5上的过渡金属和多环芳香烃可以诱导氧化应激和炎症反应。肥胖症的特征还在于氧化应激增加和炎症结果加重。检测PM2.5处理的肥胖小鼠中氧化应激，炎症和能量代谢相关基因表达的变化。肺是PM2.5进入血液循环并循环到心脏的主要部位，HFD-PM2.5组肺中TNF-α，IL-1β和IL-6均上调（图5a），表明PM2.5在HFD的干预下可诱发肺部炎症。尽管在心脏中未发现明显的表型，但PM2.5和HFD均可诱导促炎基因的表达（图5b）。ND-PM2.5小鼠中TNF-α和IL6水平升高以及HFD-PBS小鼠中IL-6水平升高表明心脏易受PM2.5和肥胖的影响。
下丘脑是释放神经递质的重要器官，因此检查下丘脑中促炎基因的表达，结果发现苯丙氨酸代谢途径的激活和儿茶酚胺的增加（图2）。共同处理显著增加下丘脑中IL-6和TNF-α水平，表明PM2.5和HFD还导致脑部炎症（图5c）。
由于嘌呤代谢相关代谢产物的升高，我们假设PM2.5诱导HFD小鼠心脏的氧化应激。检测氧化应激相关基因Nrf2，NQO-1，HO-1和SOD。结果表明，HFD小鼠心脏中几乎所有的氧化应激相关基因均被上调，PM2.5加剧了HFD诱导的Nrf2，NQO-1和SOD的表达，表明HFD与PM2.5共同处理有助于氧化应激的发生（图5d）。
为了进一步表征HFD-PM2.5小鼠心脏中脂肪酸和脂质代谢的损伤，我们研究脂肪酸代谢相关基因（图5e）。HFD-PM2.5小鼠中脂肪酸转运蛋白基因CD36和葡萄糖转运蛋白4升高，与心脏中脂肪酸和葡萄糖水平的升高一致。Dgat2是编码催化TG形成的二脂酰甘油脂酰基转移酶的基因，其表达在HFD-PM2.5小鼠中升高，与心脏中TG的升高一致。Fas和Scd1是编码从头脂肪酸合成关键蛋白以及形成油酸酯和棕榈油酸限速酶的基于，表达没有被任何处理改变。Cpt1α和Cpt1β是编码催化酰肉碱形成的肉毒碱棕榈酰转移酶的两种同工型的基因，共同处理后显著升高。这些结果表明，脂肪酸的合成可能不受处理的影响，但PM2.5和HFD干预可能促进脂肪酸的降解。此外在共同处理后，PPARα（能量缺乏条件下起作用）和UCP-1（与线粒体能量代谢能力有关）基因的表达均明显上调。连同降低的ATP和乙酰辅酶A水平（图4e）以及增加的脂肪酸水平（图4a和b）一起，这些结果一致证明了暴露于PM2.5的肥胖小鼠心脏中可能的能量供应不足。
讨论
大量的流行病学和临床研究表明，颗粒物，尤其是PM2.5，会在许多方面影响人体健康。例如，高浓度的PM2.5暴露与心血管疾病密切相关。PM2.5还会增加超重和肥胖的风险，对健康产生不利影响。高风险因素的人群（如老年人，糖尿病患者或肥胖人群）更容易受到PM触发的有害作用的影响。但是，该机制仍不清楚。本研究旨在阐明PM2.5和HFD对小鼠心脏的潜在协同作用，为了解肥胖人群PM2.5毒性机制提供了新的思路。结果表明，PM2.5导致不良健康影响，例如，在ND喂养小鼠中，PM2.5暴露4周会增加心率以及苯乙酰甘氨酸和棕榈烯酸的分子水平。PM2.5和HFD共同处理对心血管健康产生更严重的影响，并导致一些心脏功能的重大损害，例如心率和血压的异常升高，炎症和代谢途径的显著破坏。这些结果表明，肥胖加剧了PM2.5对心脏的有害影响。
先前的工作中已经鉴定出PM2.5损害心血管系统的两类机制：一类是PM2.5对心内系统的直接作用，另一种是PM2.5通过干扰其他器官（如肺脏）和自主神经系统的间接作用。本研究结果表明PM2.5对HFD诱导肥胖小鼠心脏的影响来自这两个过程。吸入性PM2.5首先沉积在肺泡中，在HFD诱导的肥胖小鼠中引起炎症（图5a）。PM2.5通过循环几乎转移到生物体的任何地方，并与肥胖结合导致下丘脑炎症（图5c）。随后促炎性细胞因子释放到血液循环中并诱发全身性炎症状态，从而影响心脏系统。先前的研究表明下丘脑炎症反应在响应各种刺激的交感神经系统激活中起关键作用。神经系统的激活会影响交感神经递质（例如肾上腺素和去甲肾上腺素）的释放，这是调节心率和血压的重要激素。我们的研究表明，PM2.5引起的下丘脑炎症激活苯丙氨酸代谢，从而升高肾上腺素和去甲肾上腺素，进而间接地以跨器官的方式增加心率和血压。
PM2.5转移到心脏中也会直接影响心脏内系统。PM2.5暴露与氧化应激有关，根据我们之前的研究，嘌呤代谢与氧化应激密切相关。嘌呤代谢中代谢物的增加表明心脏产生更多的ROS，这与氧化应激相关基因的mRNA表达一致。精氨酸和脯氨酸代谢途径的紊乱与炎症有关，这与H＆E染色结果以及心脏中促炎细胞因子mRNA水平升高一致。在心脏（而非血清）中观察到的PM2.5干扰途径可能受到PM2.5与心脏直接相互作用的影响。此外，PM2.5仅在ND-PM2.5小鼠心脏中产生细胞因子，表明PM2.5对心脏的直接影响。
能量代谢异常可能是导致PM2.5和HFD共同处理的严重后果的重要因素之一。我们的结果表明PM2.5和HFD共同处理影响脂肪酸代谢，糖酵解和脂代谢（图6）。健康的成年心脏中，脂肪酸氧化占ATP生成的绝大部分，80％的脂肪酸被迅速氧化以提供能量。在我们的研究中，PM2.5和HFD共同处理促进脂肪酸及其转运蛋白CD36的吸收。同时，上调Cpt1α和Cpt1β（酰肉碱形成的催化剂），促进β氧化。这与以前研究的HFD会促进心脏β氧化一致。泛酸（CoA的前体）的增加也表明细胞可能正在试图合成更多的CoA，这将增强脂肪酸代谢。PM2.5和HFD共同处理导致糖酵解下降，这与先前的研究一致，即增加脂肪酸氧化会抑制肥胖症中的糖酵解。脂肪酸氧化增加和糖酵解减少表明，HFD和PM2.5共同干预改变了心脏中从糖酵解到脂肪酸氧化的底物偏好。乙酰辅酶A和ATP的降低可能是归因于UCP的升高，这会降低线粒体质子梯度和ATP合成的解偶联。供应的不平衡导致脂肪酸积累，从而引发包括TG，Cer，PG和PA在内的脂质形成。结果表明脂质的积累随后引起脂毒性反应，如炎症（图6）。
能量代谢对心脏功能的重要影响已得到广泛阐明。肥胖和PM2.5诱导的毒性均被发现与能量代谢紊乱密切相关。首先，我们发现能量代谢紊乱与检测到的生理指标（例如器官重量，血压和儿茶酚胺）的变化密切相关。流行病学研究证明高血压的人体内葡萄糖和游离脂肪酸的浓度较高。毒理学研究表明高水平的游离脂肪酸可能导致血压升高。其次，能量代谢紊乱可能加剧氧化应激和炎症，从而对心脏产生更严重的不良影响。线粒体是内源性ROS的主要来源之一，能量代谢紊乱会产生大量的ROS作为有毒副产物。脂肪酸的增加和Cer的形成与ROS的产生和慢性炎症密切相关。研究表明能量代谢的重新编程可能会改变氧化还原平衡，并与复杂的炎症反应相关。综上所述，能量代谢失衡在PM2.5和HFD诱发的心脏功能障碍中起重要作用。
结论
我们的研究首次证明PM2.5通过干扰心外系统和心内系统引起心脏损伤。肥胖小鼠比正常小鼠更易受到PM2.5的影响。PM2.5和HFD结合会干扰能量代谢，并引起心脏脂毒性，炎症和氧化应激。