科研| FOOD CHEM：代谢组学方法探究微流水处理后草鱼肉质改善的机理（国人佳作）
编译：草木重雪，编辑：Emma、江舜尧。
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微流水系统可改善传统池塘养殖淡水鱼的肉质。然而，这一现象的机理尚不清楚。此研究旨在研究淡水鱼经微流动净化系统(MFPS)处理后代谢产物的变化。基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学方法筛选代谢产物，预测MFPS治疗后可能的主要代谢途径。在鱼类肌肉中鉴定出377个代谢物，其中54-71个代谢物在不同阶段的MFPS处理后显著不同。研究了MFPS处理改善草鱼鱼肉质量的主要机理，并证明了MFPS处理可改善草鱼鱼肉的肉质和风味。本研究可为提高水产品质量提供理论依据。
论文ID
原名：The mechanism for improving the flesh quality of grass carp (Ctenopharyngodon idella) following the micro-flowing water treatment using a UPLC-QTOF/MS based metabolomics method
译名：基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学方法探究微流水处理后草鱼肉质改善的机理
期刊：Food Chemistry
IF：5.399
发表时间：2020.06
通讯作者：熊善柏
通讯作者单位：华中农业大学食品科学技术学院
实验设计
实验结果
1、UPLC-QTOF/MS分析
在阳性(ES+)和阴性(ES−)模式下，使用UPLC-QTOF/MS技术检测不同纯化时间(0d、10d、20d、30d、40d和50d) MFPS处理的鱼样品中提取的代谢物。例如，图1A-1E展示了在正ESI模式下处理过的鱼样品的一系列典型总离子色谱图（TIC）的峰值强度。在18分钟内可以检测到大多数的内源性代谢物。根据峰高度，从TIC中提取的正离子(ESI+)约有4420个峰，负离子(ESI−)约有4600个峰。在这里，收集了一系列光谱来说明从提取离子色谱图(EIC:图1F-I)和质谱(图1J-M)中识别代谢物(例如组氨酸、次黄嘌呤、IMP和黄嘌呤)的步骤。与NIST标准谱图相比，草鱼肌肉中鉴定出377个代谢物，包括73个氨基酸，117个脂质，56个核酸，123个糖和碳源以及一些无机酸。从图1可以明显看出，这六个基团在TIC色谱图上存在一定的差异。然而，除了手动和直观地比较对照和处理后的色谱图，很难筛选出鱼样品中可能存在的差异代谢物。因此，应用合适的模式识别方法来可视化特征变化是非常必要的。
2、主成分分析（PCA）
PCA作为一种无监督的多变量数据分析方法，常被用来综合分析多维数据的聚类趋势，为了获得总鱼类肌肉代谢谱，最初使用PCA分析UPLC-QTOF/MS数据。
为了确定微流动净化处理是否能影响草鱼肌肉代谢模式，筛选浓度变化显著的特征代谢产物，(即潜在的生物标志物)，使用PCA方法分别对正离子和负离子数据进行建模。PCA的得分图如图2A (ES+)和S2A (ES-)所示。使用相关系数R2和交叉验证相关系数Q2评估PCA模型的有效性。R2定义为模型所解释数据的方差占比，表示拟合优度。Q2被定义为模型预测的数据中方差的比例，表示可预测性。对照组和其他5个治疗组的PCA模型R2和Q2分别为ES+模式为0.514和0.384、ES -模式为0.226和0.0198。因此，PCA方法对于ES+模式下的数据分析更有用。模型组与对照组样品完全分离。因此，在纯化过程后，草鱼肌肉的代谢模式明显改变。
此外，PCA方法还说明了ES+模式下对照组和其他5个处理组的分离。所有PCA模型的统计参数(R2和Q2)如表S1所示。主成分分析结果表明，该方法能较好地区分对照组和处理组样品，且正离子模式优于负离子模式。根据不同阶段的微流动净化系统处理，进一步探索了纯化组和对照组之间的不同代谢物组成。
3、OPLS-DA分析
为了最大化不同草鱼群体之间的分离和关注不同的净化时期的代谢变化, ES+和ESI-采集数据使用监督多元数据分析方法进行OPLS-DA分析建立更密集的和精确的模型和探索真实的趋势和分组多维数据。OPLS-DA的得分图如图2B-2F所示。与对照组相比，在不同的微流纯化处理时间点，簇的分离效果非常好。结果表明，在净化过程中，草鱼的代谢模式发生了明显的变化。OPLS-DA明显优于PCA模型，所有模型均表现出合理的组间分离和可接受的拟合优度(R2Y)和预测优度(Q2Y)。OPLS-DA模型(R2X、R2Y、Q2)的统计参数见表S1。结果不仅显示了强大的数据解释能力和所有配置的OPLS-DA模型的良好预测能力，而且还显示了微流动净化系统处理草鱼和对照组之间的强大的代谢差异。
4、微流动系统净化处理不同代谢物的鉴定
根据OPLS-DA模型测定不同代谢物的判定标准(VIP>1.5, p<0.05)，对照组和不同的纯化时间下模型组比较，在鱼肌肉样品中鉴定出145个代谢物。保留时间、分子量和潜在不同代谢物相对含量见表1。鉴定出的代谢产物主要为不同纯化时间下的脂质和脂质的次生代谢产物(图3)，说明微流动纯化处理可以改变草鱼的脂质代谢。代谢产物多为脂质分解产物的现象表明，在纯化过程中脂肪消耗增加，这与之前的研究一致。脂质代谢物中涉及许多磷脂成分，这表明大量信号分子（例如磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等）有助于纯化处理引起的代谢。
为了进一步确定草鱼微流动净化处理过程中不同代谢物中的生物标志物，研究者搜索分析了各比较组重复代谢物及其不同代谢物的相对含量。在代谢物和二级质谱数据库(METLIN)、KEGG数据库中根据分子量(m/z)对所选代谢物进行进一步鉴定。根据草鱼肌肉中不同代谢物的种类和含量变化以及KEGG数据库中报道的各代谢物的代谢途径，得到了纯化过程中草鱼肌肉代谢途径的变化（图4）。共发现16种差异显著的内源性代谢物，从纯化过程开始到纯化结束呈现出递增和递减的趋势(表1)。在这些不同的代谢物中，黄嘌呤、次黄嘌呤、三甲胺氧化物、丙氨酸和肌苷(IMP)是最常见的前体物质。它们含量的变化影响了鱼的肌肉质量。进一步讨论了这些代谢差异的原因。结合KEGG数据库中报道的代谢途径，微流动净化系统处理草鱼的潜在代谢途径如图4所示。
磷脂代谢产物如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的趋势表明，信号代谢产物的合成和代谢在纯化的早期得到增强并上调。从花生四烯酸、二十二烷酸、白三烯B4量降低和短链烷基辅酶A的增加，可以看出，草鱼肌肉净化后，脂肪酸的分解和代谢增加和脂肪酸的消费是能量的主要来源。从组氨酸、同型半胱氨酸、丙氨酸等氨基酸代谢物的变化趋势来看，纯化过程中氨基酸的分解速率大于合成速率，导致丙氨酸在鱼类肌肉中积累。纯化20天后，提高了IMP合成水平，抑制了次黄嘌呤和黄嘌呤的转化率。三甲胺氧化物及其相关代谢物在纯化过程中含量降低，代谢底物肉碱变化不明显，胆碱含量升高，说明三甲胺的生成途径被抑制。
为了验证代谢分析结果，采用高效液相色谱法测定了纯化过程中草鱼肌肉中次黄嘌呤和肌苷的含量。结果如图5所示，微流系统净化处理后，鱼肉中这两种内源性代谢物的含量明显降低，这与代谢组学的结果相符。说明纯化处理可诱导IMP对草鱼肌肉中次黄嘌呤分解代谢的抑制。结合表1和表S2所示的上述不同代谢物的变化趋势可以看出，在净化过程中，与鱼腥味相关的主要代谢物在20天内发生了显著变化。
5、MFPS处理期间草鱼肌肉的代谢变化
由于草鱼在MFPS处理期间不喂食，鱼蛋白分解并储存在组织中以维持能量供应和日常生活活动，因此鱼肌肉中蛋白质和脂质的含量呈持续下降趋势。基本上，草鱼鱼肌肉中蛋白质和脂质的消耗是根据鱼长期饥饿下能量代谢的调节而定。换句话说，在MFPS处理过程中，鱼的代谢可分为三个阶段，(I)在第一个MFPS治疗的20天，蛋白质和脂类的代谢率都非常快，(II)在MFPS过程的20d-40d期间，草鱼肌肉的分解代谢以脂质为主，直至达到鱼体内的极限。(III)MFPS处理后的最后10天，蛋白分解代谢在机体代谢中起着提供能量的重要作用。从表1和表S2可以看出，纯化10天后，组织中NADP的含量显着增加，这表明草鱼在饥饿期间的能量供应不足。从表1和表S2可以看出，纯化后第10天，组织中NADP的含量显着增加，这表明草鱼在饥饿期间的能量供应不足。这种现象与饥饿期虹鳟鱼肝细胞中发现的NADPH相关酶合成的表达趋势相吻合，这是因为鱼类中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸酶的活性显着下降，而NADPH的合成下降。纯化20-40天后，代谢蛋白和脂质程度增强，NADPH合成恢复正常水平。鱼肌肉中脂肪酸代谢的中间产物3-氧己基辅酶A和3-氧桂酰辅酶A在纯化10天后和20天后均显著增加。同时，二十二烷酸、花生四烯酸等脂肪酸含量降低，油脂合成的二次产物白三烯含量降低，说明脂肪消耗增加，合成代谢减弱。测定了草鱼背部肌肉脂肪含量，前两阶段脂肪含量变化不显著，但净化前10天脂肪含量略有增加。这些结果与鳕鱼净化研究相似，在净化过程中，鱼储存的脂质按照以下的顺序消耗，肝脏和其他内部器官、腹部、消化道和肌肉中的脂质。在长期饥饿的条件下，鲤鱼和蟑螂也发生了这种脂质代谢方式，但对于虹鳟和褐鳟来说，情况恰恰相反。
在本研究中，草鱼I期的持续时间与条纹鲈鱼和虹鳟鱼相似，II期较短。纯化过程中，同型半胱氨酸、组氨酸、同型酪氨酸等氨基酸含量下降。说明蛋白质和氨基酸的分解代谢也很活跃，除参与机体供能外，可能与磷脂酰丝氨酸的合成有关。
在纯化过程中，磷脂酰丝氨酸的合成上调幅度较大，其他磷脂如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和神经酰胺代谢物的含量也有明显变化。磷脂酰丝氨酸是细胞膜结构的重要组成部分，广泛参与调控细胞信号通路、细胞增殖和凋亡。本实验中磷脂酰丝氨酸的相对含量显著增加，这与Sousa等报道的草鱼成肌细胞现象一致。也就是说，在营养供应减少的情况下，磷脂酰丝氨酸在细胞凋亡过程中在膜内重新分布进入细胞，细胞内的蛋白质、氨基酸、核酸等物质被重复利用，维持生命活动。磷脂酰丝氨酸的上调表明，在纯化过程中的应激饥饿使草鱼细胞凋亡的调节更加活跃。因此，磷脂酰丝氨酸的积累对神经细胞的保护起重要作用。本实验数据表明，在应激性饥饿条件下，草鱼机体可通过上调磷脂酰丝氨酸的合成来保护神经系统。
6、差异代谢物与草鱼肌肉的肉品质有关
肉质的定义是由消费者根据营养价值和感官特性决定的，鱼的质量和风味应基于所研究的肉蛋白质，肽，脂肪酸和其他代谢物而定。蛋白质和氨基酸不仅属于营养成分，而且还会影响鱼的风味。收获前一定要进行一段时间的净化和剥夺食物，这通常是改善鱼的质量和风味的常用程序，而且净化后的鱼（净化后2-4周）被发现具有一致且理想的风味。因此，研究了代谢物的变化，特别是氨基酸，这些在决定鱼的品质和风味中起重要作用。
6.1、肌苷单磷酸
纯化20天后，鱼体内IMP含量显著提高，而鱼肌肉中黄嘌呤和次黄嘌呤含量显著降低。IMP可分别通过在鱼体内转化的黄嘌呤核苷和肌苷降解为黄嘌呤和次黄嘌呤。草鱼肌肉细胞IMP、黄嘌呤以及次黄嘌呤相对含量增加表明MPFS处理后IMP降解被抑制。因此，在鱼的肌肉中积累了大量的IMP。
同时，IMP可以被代谢物AICAR分解。PRPP代谢的另一个方面是组氨酸，肌肉中组氨酸的含量降低了。可以看出，纯化过程中的PRPP代谢主要是通过AICAR合成IMP进行的。当Kuhla等人研究奶牛蛋白的表达时，他们发现AICAR甲基转移酶/ IMP环化酶的表达在饥饿状态下被上调，并且IMP的合成得到增强，从而补充和维持了IMP的腺嘌呤核苷酸的总量。
6.2、三甲胺N-氧化物
TAMO可以通过TAMO还原酶催化生成三甲胺和二甲胺，这是鱼或水产品中的两个主要异味成分。在这项研究中，MFPS处理过程中TAMO及其相应代谢产物的含量降低，表明纯化过程有助于减少肌肉的异味，从而提高草鱼的质量。
6.3、丙氨酸
丙氨酸作为谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸等氨基酸代谢的主要代谢物，可进一步代谢为丙酮酸，进入TCA循环和能量代谢。纯化过程中氨基酸分解程度高，丙氨酸含量丰富。能量供应的主要形式是脂肪酸代谢，经过50天的净化后达到机体内脂肪酸的极限。供能方式转变为蛋白质和氨基酸，丙氨酸含量较对照组恢复。此外，由于MPFS处理饥饿和纯化过程，AlaAT的活化降低也可能导致丙氨酸的富集，在丙氨酸转化为丙酮酸和谷氨酸的循环中能催化丙氨酸转化为丙氨酸-酮戊二酸。
鱼肉肌肉中的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸直接影响鱼肉的风味，因此这四种氨基酸含量越高，鱼肉的品质越好。因此，可以推断纯化处理可以通过增加丙氨酸来改善鱼肉的风味。
6.4、肉质和代谢产物
通过分析主要差异代谢物和报告的代谢途径数据库，了解MFPS的机制，改善草鱼肉质的方法得出以下结论：纯化期间不饲喂产生的饥饿胁迫导致草鱼肌肉ATP水平下调，诱导肌肉细胞嘌呤代谢途径发生显著变化，由次黄嘌呤转移到IMP合成，导致次黄嘌呤浓度降低。与此同时，在ATP水平下降诱导大量凋亡信号分子合成，从而加速部分细胞的凋亡过程，这些细胞利用储存的蛋白和脂质产生能量，最后与IMP一起反馈，维持正常的ATP水平。基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学研究了饥饿是否是代谢途径改变促进IMP积累的主要驱动力，结果表明鱼肌肉中某些氨基酸的风味显著改善。然而，脂类的摄入影响了鱼的质地和味道。饥饿期间，由于TMAO底物之一肉碱的供应不足，导致TMAO及其下游代谢物的积累减少，从而导致鱼的肌肉风味下降。差异代谢物中，次黄嘌呤、IMP和丙氨酸对鱼肌肉风味的影响最大，且在微流动纯化过程中其含量变化显著，可作为草鱼纯化处理的潜在生物标志物。
总结