科研| ENVIRON POLLUT:代谢组学揭示Cu对小球藻的毒性机理(国人佳作)
编译:寒江雪,编辑:谢衣、江舜尧。
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为了比较水生生物对氧化铜(CuO)纳米颗粒(NPs)、CuO微粒(MPs)和铜(Cu)离子毒性的响应,通过代谢组学研究普通小球藻暴露5d后极性和非极性代谢物的变化,以及相应的溶解态铜离子(0.08和0.8 mg/L)的变化,并比较了CuO NPs与MPs和Cu离子对水生生物毒性的影响,探讨了CuO NPs和MPs(1 mg/L和10 mg/L)对小球藻(Chlorella Commgaris)极性和非极性代谢产物的影响。普通小球藻生长不变,活性氧产生较少,膜损伤明显。共鉴定75种差异代谢物,露于CuO NPs后的大多数代谢途径与暴露于CuO MPs和Cu离子后的代谢途径是相同的。对颗粒和对离子的代谢反应的差别是脂肪酸氧化产物的积累。与MPs 相比,没有NPs特异性的途径参与响应。这些结果证实了溶解态Cu离子对CuO NPs和MPs毒性的主导作用,并从代谢组学角度揭示了颗粒特异性毒性。
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实验设计
本研究将小球藻分别暴露于0.08mg/L,1 mg/L和10 mg/L的铜离子,CuO NPs和MPs中。测定暴露后的表型特征,细胞内活性氧和膜损伤。并对其进行代谢组学的分析,分析差异代谢物及代谢途径,揭示颗粒特异性毒性。
实验结果
1微藻生长
各暴露组的藻细胞密度在暴露5天内逐渐增加,且与对照组在各天时间点的藻细胞密度均无显著差异(P>0.0 5)。表明在本实验条件下,10 mg/L的CuO NPs和MPs对普通小球藻的生长没有明显的抑制作用。0.08 mg/L的铜离子使细胞密度略有增加,而10 mg/L的CuO NPs在第3、4、5天对细胞密度有轻微的抑制作用。
2细胞内的活性氧与膜损伤
发现在较高的暴露浓度下ROS有微弱的增加的趋势,但在统计学上并不显著。低浓度暴露4天以上比暴露1、4天后产生的活性氧要少,这可能是由于长期暴露后藻类的毒性耐受性和恢复能力所致。本研究选择了120h的暴露时间,使CuO颗粒与藻细胞充分相互作用,从而使观察到的毒性效应更具环境相关性。
图1显示了在较高的暴露浓度下膜损伤增加的趋势。与对照组相比,只有10 mg/L的CuO NPs (p<0.01)和MPs (p<0.05)出现明显的膜损伤。铜离子暴露对膜的损伤相对较小,NPs对膜的损伤比MPs严重,这与前人报道一致。
3代谢组学分析
从LC-QTOF光谱的六个数据集中提取的特征的PCA散点图如图2所示。研究人员发现在MTBE层中脂质的分化是由于较高的暴露浓度,而不是由于离子、MPs和NPs之间的差异。在甲醇/水层的RPLC谱中可以清楚地观察到CuO NPs和MPs基团与Cu离子基团的分离。将对照组与每种污染物类别进行单独比较时,还观察到不同浓度和对照组之间的分离。说明污染物种类和浓度对甲醇/水层代谢物的变化有影响。在甲醇/水层HILIC图中,1 mg/L组比10 mg/L组与对照组的微粒分离更显著。这表明不同微粒子暴露引起的甲醇/水层中某些代谢物的差异而非浓度引起。
4差异代谢物和差异代谢通路
MTBE层,甲醇/水层HILIC和甲醇/水层RPLC的阴阳模式分别确定了20、18、7、33、6和11种,共75种代谢物。这些代谢物包括叶绿素衍生物、磷脂、甘油酯、核苷酸及其磷酸盐衍生物、脂肪酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、碳水化合物和谷胱甘肽等。许多极性代谢物可以在离子、NPs和MPs之间区分开,而大多数代谢物随着铜基材料浓度的增加而增加或减少。几种代谢物(脂肪酸及其衍生物和某些二酰甘油)在1 mg/L时的强度浓度明显高于对照组和10 mg/L组。这一趋势与上述PCA分析的结果是一致的。下面是小球藻暴露于铜基材料后代谢途径的变化(图3)。
4.1叶绿素中间体的积累
叶绿素中间体叶绿素a、叶绿素b、甲基叶绿素a、甲基叶绿素b、脱镁叶绿酸a和脱镁叶绿酸甲酯均随暴露浓度的增加而积累。高浓度铜基材料的叶绿素a和叶绿素b含量显著高于对照组,而离子、NPs和MPs之间差异不显著。与对照组相比,暴露组的叶绿素a和叶绿素b的峰面积没有明显变化。暴露于铜基材料并没有引起小球藻叶绿素的显著减少,这可能是由于叶绿素合酶的激活导致了叶绿素的补充。因此推测更敏感的物种或更高浓度的铜基材料可以显著降低叶绿素含量。利用代谢组学捕捉到了小球藻叶绿素中间体的积累,可能是叶绿素降解或生物合成受损的早期迹象。
4.2膜脂重塑
所有磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)种类在暴露于铜基材料后均呈浓度增加而减少。磷脂酸(PAs)、磷脂酰甘油(PGs)、溶血磷脂酸(溶血PAs)、溶血磷脂酰乙醇胺(溶血PEs)、溶血磷脂酰甘油(溶血PGs)、溶血磷脂酰肌醇(溶血PIs)等均会随着暴露剂量的增加而显著增加(图4)。磷酸甘油脂类是细胞膜双层的主要成分,由于聚天冬氨酸的积累破坏了膜双层结构,并导致脂质颗粒的形成,最终降低了膜的完整性。本研究中暴露于铜基材料后细胞膜损伤的增加可能是PA积累的结果(图1)。PA是植物中一种广泛且多功能的胁迫信号脂质,在各种胁迫条件下PA会在植物中增加。本研究中,PA的产生可能是微藻对铜基材料暴露引起的氧化应激和膜破裂的应激反应。单半乳糖基二酰基甘油(MGDGs)、部分二酰基甘油(DAG(36:6)和DAG(36:5))和二半乳糖基单酰基甘油(DGMGs)在暴露后增加。MGDG和DGDG是类囊体的初级结构脂质,在叶绿体发育和保护光合作用复合体的正常功能中起着关键作用。本研究中,MGDG增加而DGDG不变,导致MGDG/DGDG比率升高。这是微藻细胞抵消暴露于铜基材料造成的膜损伤增加的防御策略(图1)。总之,暴露于铜基材料后膜脂重塑表明藻类细胞对暴露的应激反应,并加强类囊体膜以保护光合作用的正常进行。
4.3谷胱甘肽代谢
暴露于铜基材料后,GSSG、GSH二羧乙基和GSH-葡萄糖醛酸含量降低,而半胱氨酰甘氨酸二硫化物和焦谷氨酸含量增加(图3和图5)。0.8 mg/L铜离子和10 mg/L CuO、MPs和NPs暴露后,GSH略有下降,但无显著性差异(图5)。暴露组GSH向游离GSH的转化增加,GSSG的水解增加。这些代谢转化表明,在铜离子、CuO、MPs和NPs组中,微藻细胞产生了更多的GSH,并被用来中和ROS或合成植物螯合蛋白。虽然高浓度组的GSH略低,但GSSG的水解使GSH/GSSG比值在暴露组略高。离子、NPs和MPs之间的GSH/GSSG比值无显著差异。本研究中稍高的谷胱甘肽/GSSG比值可能表明微藻细胞在暴露5天后已经达到适应阶段。总的来说,谷胱甘肽代谢的紊乱表明藻类细胞在暴露期间经历了氧化应激胁迫,但随着时间的推移逐渐会逐渐适应。
4.4渗透调节物质的积累
渗透调节因子是帮助细胞抵消渗透压力的分子。几种常见的渗透调节因子在暴露组中呈上调趋势,暴露组中过量溶解的铜离子对细胞膜施加了额外的渗透胁迫。甘露醇、脯氨酸、甜菜碱和天冬氨酸的积累可能是微藻细胞抵御渗透胁迫和螯合内化铜离子的防御策略。
4.5脂肪酸的颗粒特异性干扰及其氧化
研究中发现了几种被CuO颗粒暴露特异性干扰的代谢物,包括脂肪酸及其氧化产物,脂肪酸及大量的氧化脂质的积累。所有这些脂肪酸和氧化脂质都呈现出相似的趋势,从对照组到1 mg/L颗粒组逐渐增加,然后逐渐下降,1 mg/L CuO MPs组和NPs组显著上调(图6)。与Cu离子相比,CuO颗粒在1 mg/L时引起较大差异,在10 mg/L时引起较低差异。植氧脂作为信号分子和/或保护性代谢物,在植物抵御病原体或其他危及生命的事件中发挥着重要作用。铜离子暴露后微藻中氧脂的积累可能是启动信号事件的标志和防御策略。目前尚不清楚1 mg/L CuO MPs和NPs暴露组脂肪酸和氧脂异常积累,而10 mg/L CuO MPs和NPs暴露组相对较低的原因,但可能与粒子触发防御策略有关,因为这两个铜离子组均未观察到这种现象。一种假设是,在10 mg/L的CuO MPSs和NPs中,游离脂肪酸通过与DAG反应循环合成储脂三酰甘油。两种情况下,CuO NPs诱导了饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸比值的特异性改变。颗粒对脂肪酸氧化具有特异的破坏模式,藻细胞的膜流动性可能由于颗粒的附着而特异性地降低。研究这种独特的CuO颗粒特异性效应对脂肪酸代谢的作用机制将是未来的研究热点。
4.6其他代谢途径
未在上述讨论中涉及的重要代谢物包括腺苷、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸肌苷(IMP)和一磷酸鸟苷(GMP)。其中ADP和腺苷上调最显著,并且在离子、NPs和MPs之间没有显著差异。表明通过能量消耗增加暴露后藻类细胞的自我保护。
结论
小球藻暴露于1和10 mg/L的CuO、MPs和NPs以及相应的铜离子5天后,藻类生长不变,表型出轻微的氧化应激和膜损伤。代谢组学分析发现,与CuO、MPs和Cu离子暴露相比,CuO NPs暴露引起如下代谢途径的变化:叶绿素中间产物的积累、膜脂重塑、谷胱甘肽代谢紊乱和渗透调节物质的积累。谷胱甘肽代谢紊乱可能与氧化应激有关,而膜脂重塑和渗透调节物质的积累可能与膜损伤有关。CuO颗粒和Cu离子的代谢反应之间的唯一区别是脂肪酸氧化产物的积累,这表明额外的颗粒特异性毒性。CuO、NPs和MPs的毒性主要来源于溶解的Cu离子。这些结果为CuO纳米颗粒 NPs和MPs的毒性模式提供了新的证据,也为今后的CuO纳米颗粒和MPs的安全设计和管理提供了新的依据。这项研究突出了代谢组学作为纳米毒理学研究中灵敏的分子工具的优点。
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原文网址:https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.113647