编译：篱落，编辑：Tracy、江舜尧。
导读
肺癌是影响人类的最致命癌症之一,约85％的肺癌患者分属非小细胞肺癌（NSCLC）组织学亚型。化疗联合以铂为基础的双重疗法是针对肺癌晚期患者的标准治疗方法；然而，治疗的临床耐药性仍然是一个挑战，极大地阻碍了治疗的成功，因此，我们有必要更全面地了解肺癌的耐药机制，以全面抗击该疾病。已有研究报道，外泌体在肺癌的发生发展中起着重要作用，最近的一项研究表明，EphA2蛋白通过外泌体传递增强了胰腺癌对吉西他滨的耐药性，因此，外泌体可能通过直接将生物分子转移到其它细胞、或通过改变微环境来影响细胞功能。缺氧是大多数恶性肿瘤中常见的现象，与耐药和肿瘤发生有关。许多研究都探讨了缺氧对肿瘤环境的影响，然而，对环境以及缺氧诱导的外泌体与非小细胞肺癌顺铂耐药相关的机制知之甚少。在这项研究中，我们证实了低氧诱导通过增强PKM2的表达和促进糖酵解在促进顺铂耐药中发挥重要作用，从机制上讲，缺氧诱导的外泌体被发现在耐药机制中起重要作用。本研究中，我们主要关注肺癌中低氧诱导的外泌体通过将PKM2转移到肿瘤细胞中，从而直接导致顺铂耐药，我们还重点研究了低氧诱导的外泌体如何通过重新编程癌症相关成纤维细胞(CAF)间接促进顺铂耐药，CAF重编程后代谢的变化调节了癌旁细胞对顺铂的耐药性。研究结果揭示了非小细胞肺癌顺铂耐药的新机制，并为抗肿瘤治疗提供了一种有前景的代谢阻滞剂。
原名：Cisplatin-resistant NSCLC cells induced by hypoxia transmit resistance to sensitive cells through exosomal PKM2译名：缺氧诱导的非小细胞肺癌顺铂耐药细胞通过外泌体PKM2向敏感细胞传递抗药性
微环境缺氧是肿瘤最重要的特征之一，为了探讨缺氧在顺铂耐药中的作用，我们用IC50曲线筛选了顺铂耐药的A549细胞株(A549/CR)，检测结果显示A549/CR细胞比A549/SEN敏感细胞对顺铂的耐药性更强(图1A)。为阐明缺氧对NSCLC细胞表型的影响，我们采用克隆形成实验测定了A549/SEN和A549/CR细胞在常氧和缺氧条件下的细胞活力，结果表明，A549/SEN细胞在正常和低氧条件下的增殖情况无明显差异。A549/CR细胞在低氧条件下的克隆数明显高于常氧条件下的克隆数，而A549/CR细胞在低氧和常氧条件下的克隆大小无显著差异(图1B)，A549/CR细胞在低氧条件下的克隆数明显高于常氧条件下的克隆数(图1B)；同时，A549/CR细胞对缺氧的耐受性高于A549/SEN细胞(图1C)，说明耐顺铂细胞在NSCLC实体瘤的缺氧环境中更为常见。接下来，我们在常氧和低氧环境下培养A549/SEN和A549/CR细胞，并加入顺铂。有趣的是，我们发现低氧进一步增加了A549/CR细胞对顺铂的耐药性，而这种趋势在A549/SEN细胞中没有观察到(图1D-E)，这些结果表明，NSCLC细胞在低氧环境下对顺铂的耐药性增加。
(A)顺铂处理A549/SEN和A549/CR细胞48h后，两种细胞对顺铂的IC50值差异有差异(P<0.001)。(B)A549/SEN和A549/CR细胞在常氧和低氧条件下培养后的克隆形成情况统计。(C)CCK8检测A549/SEN和A549/CR细胞的缺氧耐受能力。(D)A549/SEN细胞在常氧或低氧条件下经不同浓度顺铂处理48h后的细胞存活率。(E)A549/CR细胞在常氧或低氧条件下，经不同浓度顺铂处理48h后的细胞存活率分析。
由于先前的研究表明厌氧糖酵解导致肿瘤细胞产生耐药性，我们接下来研究了A549/SEN、A549/CR和低氧培养的A549/CR(hA549/CR)细胞中的糖酵解水平。与A549/SEN细胞相比，A549/CR细胞吸收了更多的葡萄糖，产生了更多的乳酸；此外，缺氧进一步增加了A549/CR细胞的糖酵解水平(图2A-B)；同时，我们还观察到HK2、LDHA和PKM2三种关键糖酵解酶表达升高。A549/CR细胞中PKM2的表达明显高于A549/SEN细胞，缺氧进一步增强了其在A549/CR细胞中的表达(图2C)；然而，HK2和LDHA的表达水平在三组之间没有显著差异(图2C)，此外，低氧诱导还增强了A549/CR细胞中PKM2的活性。我们还发现，与A549/CR细胞或A549/SEN细胞相比，hA549/CR细胞中PKM2-HIF-1α和PKM2-β-Catenin信号通路上调(图2D)。免疫共沉淀实验显示，与A549/SEN细胞相比，高表达PKM2的HA549/CR细胞中检测到了更多的HIF-1α和β-catenin。由于PKM的mRNA能编码PKM1和PKM2亚型的剪接体，我们也同时探讨了PKM1在三组中的表达没有差异。我们用PKM2敲除的细胞A549/SEN(A549/SENshPKM2)、A549/CR(A549/CRshPKM2)和hA549/CR(hA549/CRshPKM2)，观察了其糖酵解的进展情况。结果表明，PKM2敲除的A549/SENshPKM2、A549/CRshPKM2和hA549/CRshPKM2细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的产率无显著差异，这表明PKM2在糖酵解的调节中起着重要的调节作用。接下来，为了确定PKM2是否调节NSCLC细胞对顺铂的耐药性，我们利用FLAG标记的PKM2的质粒在A549/SEN细胞(A549/SENPKM2)和PC9细胞(PC9PKM2)中过表达PKM2；同时，在A549/CR细胞(A549/CRshPKM2)中，我们通过基因敲除抑制PKM2的表达，结果显示，PKM2过表达促进了A549/SEN和PC9细胞的生长(图2E)，而下调PKM2则抑制了A549/CR细胞的生长(图2F)。在低氧条件下，PKM2过表达增加了A549/SEN和PC9细胞对不同浓度顺铂的耐药性(图2G)，而PKM2基因敲除则回复了A549/CR对顺铂的敏感性(图2H)。我们发现，联合使用顺铂和PKM2抑制剂，能比单独使用这些药物，对hA549/CR细胞的增殖抑制作用更强(图2I)。综上，PKM2通过增加低氧诱导的糖酵解，促进NSCLC细胞的顺铂耐药性。
外泌体已被广泛证实能够影响肿瘤对各种药物的耐药性，这促使我们探索hA549/CR细胞的外泌体是否会改变敏感细胞中顺铂的药物抗性。首先，绿色荧光染料PKH67标记的外泌体被掺入A549、H1299和PC9细胞中(图4A)，以确认顺铂敏感细胞有效地整合了外泌体SENexo、CRexo和hCRexo。接下来，我们确定了外泌体的处理浓度，并评估了NSCLC细胞对顺铂的耐药性。与SENexo或CRexo相比，hCRexo增强了A549(图4B)、H1299(图4C)和PC9(图4D)细胞对顺铂的耐药性；同时，我们发现hCRexo处理也提升了顺铂敏感细胞中PKM2的蛋白含量(图4E)，但其mRNA水平没有变化(图4F)。这表明hCRexo直接将PKM2转移到敏感细胞，而不影响PKM2的mRNA水平。吸收hCRexo后的药物敏感型A549细胞高表达PKM2，并表现出更高的PKM2依赖的非代谢转录活性(图4F)。免疫共沉淀分析表明，hCRexo中的PKM2与A549/SEN细胞核裂解产物中的HIF-1α和β-catenin相互作用，表明转入细胞核的PKM2通过募集HIF-1α和β-catenin途径来激活这些信号通路。为了确定外泌体PKM2是否能诱导敏感细胞对顺铂产生耐药，外泌检测了顺铂作用下A549/SEN细胞的存活率。hA549CR敲除PKM2细胞(hCRexoshPKM2)的外泌体和对照细胞的外泌体(hCRexoshNC)被用于该实验设计。
A549/SEN细胞用hCRexoshPKM2外泌体处理后，细胞对顺铂的敏感性有所恢复(图4G)，并且PKM2依赖的转录活性降低(图4H)。此外，我们收集了经PKM2抑制剂处理的hA549/CR细胞的外泌体(hCRexoPKM2-In)，发现这些hCRexoPKM2-In外泌体不能将顺铂耐药性传递给A549/SEN细胞。这些结果表明，hCRexo通过传递PKM2蛋白，使敏感细胞产生顺铂耐药性。
图4 外泌体PKM2向敏感型NSCLC细胞传递顺铂耐药性（A）用PKH67染色的SENexo、CRexo和hCRexo(绿色)处理A549/SEN、H1299和PC9细胞的荧光图，用鬼笔环肽(红色)和DAPI(蓝色)染色以显示外泌体摄取情况。（B-D）用40μg/mLSENexo、CRexo和hCRexo处理A549/SEN(B)、H1299(C)和PC9细胞(D)48h后，再用顺铂处理48h的细胞活力检测。(E) PKM2在处理细胞中的表达情况。(F)qRT-PCR检测GLUT1、MYC、CCND1、PDK1、LDHA和PKM2mRNA水平。(G)A549/SEN细胞与经shNC慢病毒(hCRexoshNC)或shPKM2#1慢病毒(hCRexoshPKM2)处理的hA549/CR细胞分离的外泌体共培养后的CCK8检测(左)。免疫印迹(右)检测外泌体中的PKM2。(H)外泌体处理的A549/SEN细胞中GLUT1、MYC、CCND1、PDK1和LDHAmRNA水平。5.耐低氧细胞产生的外泌体通过增加代谢物抑制顺铂诱导的细胞凋亡为了探讨hCRexo促进NSCLC细胞顺铂耐药的机制，我们首先检测了顺铂作用下与SENexo、CRexo和hCRexo共培养的A549/SEN细胞的凋亡情况。SENexo和CRexo处理的A549/SEN细胞均出现顺铂诱导的凋亡现象，而hCRexo组与顺铂处理的A549/SEN细胞凋亡情况无明显差异(图5A)；同时，hCRexo处理明显减轻顺铂诱导的细胞核不规则、凝聚和碎裂等现象，表明hCRexo抑制顺铂诱导的细胞凋亡，此外，hCRexoshPKM2外泌体在顺铂处理的A549/SEN细胞中失去了其抑凋亡能力(图5B)。顺铂处理后，hCRexo处理的A549/SEN细胞BCL2表达增加，cleaved-caspase 3水平降低，而hCRexoshPKM2逆转了这一作用(图5C-D)。考虑到细胞内活性氧(ROS)与细胞凋亡和化疗效应有关，我们分析了hCRexo在顺铂处理后对A549/SEN细胞内ROS水平的影响。与CRexo和SENexo相比，hCRexo显著减少了顺铂诱导的ROS阳性细胞数量(图5E)；而在hCRexo调控的ROS水平抑制中，这种抑制作用在PKM2下调后显著减弱(图5F)，因此，通过hCRexo递送PKM2可清除顺铂诱导的敏感细胞内的ROS。已知PKM2能募集Hsp90使BCL2在其69位苏氨酸残基(T69)发生磷酸化，以稳定BCL2、抑制ROS诱导的细胞凋亡，因此，我们推测PKM2调控的外泌体可能也使用了类似的机制。我们用免疫共沉淀法验证顺铂作用后外泌体对A549/SEN细胞中PKM2-Hsp90和PKM2-BCL2的互作，发现hCRexo通过传递PKM2增强了BCL2的表达，增加了T69磷酸化，并发现hCRexo促进了PKM2对Hsp90和BCL2的募集作用(图5G)。在A549/SEN细胞中，hCRexo中PKM2的敲低没有提升的BCL2表达和磷酸化的活化水平(图5H)，这些结果表明，hCRexo通过诱导PKM2和BCL2之间的相互作用来抑制ROS介导的细胞凋亡。还原型谷胱甘肽(GSH)由NADH维持在还原状态，是一种重要的抗氧化剂，可以消除ROS。与CRexo和SENexo组相比，hCRexo组使降低的NADH(图5I)和GSH(图5J)水平回复；与hCRexoshNC相比，hCRexoshPKM2处理降低了NAPH(图5I)和GSH(图5J)的含量。综上所述，hCRexo通过促进PKM2依赖的BCL2活化和回复PKM2介导的代谢途径中降低的NADH和GSH水平，来抑制NSCLC细胞的凋亡。
图5 hCRexo通过PKM2抑制顺铂诱导的细胞凋亡(A-B) 40μg/mL外泌体处理A549/SEN细胞48h后，4μg/mL顺铂处理48h的A549/SEN细胞的图像(左)和凋亡细胞比例(右)。图示用SENexo、CRexo、hCRexo(A)、hCRexoshNC和hCRexoshPKM2(B)处理A549/SEN细胞。(C-D)凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、caspase-3、bax和BCL2在处理细胞中的免疫印迹检测。(E-F)流式细胞术和细胞计数法检测DCFH-DA阳性细胞比例。(G)与40μg/mLCRexo或hCRexo共培养的A549/SEN细胞，用4μg/mL顺铂(或载体)处理。免疫沉淀PKM2蛋白并用免疫印迹法检测PKM2的互作蛋白。(H)用4μg/mL顺铂(或载体)处理与hCRexoshNC或hCRexoshPKM2共培养的A549/SEN细胞，免疫印迹检测 BCL2和BCL2 p-T69。(I-J)40μg/mLSENexo、CRexo、hCRexo、hCRexo、hCRexoshNC或hCRexoshPKM2处理的A549/SEN细胞的总NADH/NAD+(I)和谷胱甘肽/T-谷胱甘肽(J)。6.耐低氧细胞的外泌体通过传递PKM2来重新编程CAF代谢，以增强敏感细胞的耐药性研究证实，外泌体能调节CAFs（癌症相关成纤维细胞）的代谢重编程，从而改善肿瘤恶性微环境。我们证实了hCRexo能改变CAFs的糖酵解水平，并通过CAF相关的代谢改变影响顺铂对A549/SEN的治疗成效。我们从人肺癌组织中分离出两种CAFs，并与外泌体共培养，PKM2在hCRexo处理的两个CAF中表达最高(图6A)。共聚焦显微镜获得的CAF-1图像显示外泌体被CAF吸收(图6B)，经hCRexo处理后CAF中PKM2水平增加(图6C)。综上所述，这些发现表明hCRexo能将PKM2转移到CAFs；此外，我们测试了经hCRexo预处理的CAFs能否与NSCLC细胞一起发挥功能。我们用CAFs预处理外泌体48小时，然后与A549/SEN共培养，以分析A549/SEN细胞的表型改变(图6D)，发现与经CRexo或SENexo预处理的CAFs相比，经hCRexo预处理的CAFs对A549/SEN细胞的顺铂耐药性显著增加(图6E)。克隆形成实验显示，hCRexo预处理组的克隆数高于CRexo或SENexo预处理组(图6F)。此外，Transwell实验显示，经hCRexo预处理的CAFs显著增加了A549/SEN细胞的侵袭能力(图6G)。与SENexo或CRexo相比，hCRexo处理的CAF的葡萄糖摄取(图6H)、胞外丙酮酸(图6I)和乳酸分泌(图6J)明显增加，而hCRexoshPKM2处理降低了CAF的糖酵解。我们在CAFs中过表达FLAG标记的PKM2，发现PKM2的上调促进了CAFs中的糖酵解，而与hCRexo预处理的CAFs共培养结果相似，直接加入乳酸和丙酮酸也可促进A549/SEN细胞的顺铂耐药性(图6K-L)、增殖和侵袭能力。这些结果表明，经CAFs预处理的hCRexo可促进CAF代谢重编程诱导的A549/SEN细胞对顺铂的耐药性。
图6 hCRexo重编程CAF代谢以促进敏感NSCLC细胞的顺铂耐药（A）将两株CAF细胞系分别与PBS、SENexo、CRexo或hCRexo共培养。免疫印迹法检测上述细胞中PKM2的表达。（B）PKH67标记(绿色)的SENexo、CRexo和hCRexo与CAFs孵育后的荧光共聚焦显微镜观察结果。细胞核用DAPI(蓝色)染色，细胞骨架用鬼笔环肽(红色)染色。(C)SENexo、CRexo和hCRexo处理的CAF中Cy3标记的PKM2(红色)的免疫荧光图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。(D)CAF与A549/SEN细胞共培养示意图。用SENexo、CRexo或hCRexo预处理CAFs，然后在4μg/mL顺铂处理后与A549/SEN细胞共培养。(E)处理细胞的细胞活力检测。(F)处理细胞的相对菌落数(右)和代表性图像(左)。(G)处理细胞的Transwell图(左)和侵袭率统计(右)。(H-J)CAF经40μg/mLSENexo、CRexo和hCRexo处理48h后，在无血清培养基中进行葡萄糖摄取试验(H)、胞外丙酮酸产生试验(I)和乳酸产生试验(J)。(K-L)4μg/mL顺铂作用48h后，用不同浓度的丙酮酸(K)和乳酸(L)处理A549/SEN细胞的细胞活性检测结果。为了在体内环境研究hCRexo对顺铂的耐药传递功能，我们利用A549/SEN细胞建立了小鼠皮下移植模型。肿瘤大小相近的小鼠随机分为四组(图7A)。我们观察到CRexo处理组的肿瘤生长慢于hCRexo处理组，并且顺铂处理显著抑制了CRexo组的肿瘤体积和重量，而在hCRexo处理组，顺铂并没有改变肿瘤的生长情况(图7B-D)。此外，IHC实验显示，与CRexo相比，hCRexo处理显著增加了肿瘤组织中BCL2、磷酸化BCL2、PKM2和GLUT1的表达水平(图7E和图S7)。与CRexo不同，hCRexo不增加顺铂诱导的细胞凋亡，TUNEL检测结果为阴性，cleaved-caspase 3的表达水平降低(图7E)。这些结果表明，hCRexo可促进PKM2的表达、提升体内的葡萄糖代谢，从而维持NSCLC细胞对顺铂的耐药性。为了对临床意义进一步探索，我们构建了稳定表达荧光素酶的A549/CR细胞，并将它们注射到随机选择的肿瘤体积相似的裸鼠体内(图7A)。结果显示，给予PKM2抑制剂能抑制肿瘤生长，而与单独使用两种药物相比，PKM2抑制剂和顺铂联合使用显著抑制肿瘤生长(图7G-H)，荧光素酶实时生物发光成像也证实了这些结果(图7I)。总的来说，这些体内数据与我们的体外结果一致，表明hCRexo增强了NSCLC细胞对顺铂的耐药性，靶向PKM2可能是对抗顺铂耐药非小细胞肺癌的有效策略。
图7 hCRexo在体内促进NSCLC细胞对顺铂的耐药(A) 用A549/SEN或荧光素酶(Luc)标记的A549/CR细胞建立小鼠异种移植瘤模型示意图。(B)CRexo和hCRexo处理的A549/SEN细胞移植的裸鼠经顺铂处理或对照空载处理后的肿瘤图像。(C-D)测量B组中裸鼠的肿瘤体积(C)和肿瘤重量(D)。(E)H&E染色、PKM2、GLUT1和 cleaved-caspase 3(cl-caspase 3)的免疫组化染色及肿瘤组织的TUNEL检测。(F)表达荧光素酶的A549/CR细胞移植瘤的裸鼠，用顺铂，或PKM2-IN，或顺铂和PKM2-IN联合治疗后的肿瘤大小。（G-H）在（F）处理的裸鼠中，测量肿瘤体积(G)和肿瘤重量(H)。（I）该模型的活体生物发光成像。在本研究中，我们揭示了外泌体PKM2能传递NSCLC化疗耐药性及其机制。肿瘤内的缺氧区域通常对化疗更有抵抗力，这些缺氧性耐药细胞使用两种方法传递耐药性(图8)：首先，耐低氧顺铂的细胞分泌含有高水平PKM2的外泌体，并被周围的敏感细胞吸收，外泌体PKM2还能调节敏感细胞的糖酵解、产生更少的代谢物，并能中和顺铂诱导的ROS，或以PKM2-BCL2依赖的方式抑制细胞凋亡；其次，低氧顺铂耐药细胞分泌的外泌体将PKM2运送到肿瘤微环境中的CAFs中，代谢重新编程的CAFs释放丙酮酸和乳酸，促进敏感细胞的增殖、侵袭和化疗耐药。
图8 缺氧诱导的外泌体PKM2促进NSCLC细胞顺铂耐药的示意图治疗非小细胞肺癌需要更理想的治疗方法，而实体瘤的缺氧是目前治疗方法失效的原因之一，所以有必要全面了解肺癌细胞耐药的分子机制，这将为我们提供新的预后预测因子。本研究表明，NSCLC细胞在低氧环境中通过增加PKM2的表达来增强耐药性，在缺氧诱导的耐药和敏感细胞中，HK2和LDHA等代谢酶的蛋白水平没有明显变化。然而，我们发现三组细胞(A549/SEN、A549/CR和hA549/CR)中的LDHA mRNA水平都发生了变化。人们普遍认为，转录和翻译是两个独立的过程，其中包含不同的功能复合体和调控机制。尽管一些研究表明转录和翻译之间存在一定程度的依赖，但最近对转录组-蛋白质组关系的研究发现，某些基因的mRNA/蛋白质表达情况并不一致。在我们的研究中，不同细胞系的LDHA基因表达水平明显不同，但蛋白表达水平保持不变。不同程度的mRNA和蛋白降解率可以解释为什么mRNA和蛋白质水平没有相关性，这也可能是由于某些其它因素干预了LDHA mRNA的翻译过程，该机制需要进一步研究。外泌体是一种新的细胞间通讯方式，能将各种生物分子(如蛋白质、mRNAs和miRNAs)转移到不同的细胞中。许多研究表明，缺氧诱导的外泌体能通过传递蛋白质或遗传信息，影响受体肿瘤或间质细胞的表型转化，例如，缺氧的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体通过介导miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100的转移来激活STAT3信号诱导的EMT，从而促进肺癌的转移；缺氧肿瘤细胞外泌体中的WNT4通过激活β-连环蛋白信号来促进结直肠癌的转移；缺氧肿瘤细胞外泌体中的microRNA 486-5p、181a-5p和30d-5p是高危局部进展期直肠癌(LARC)的marker等。然而，关于缺氧诱导的外泌体对肿瘤细胞和微环境之间的互作关系影响研究有限。本研究显示，耐低氧肿瘤细胞的外泌体作用于敏感肿瘤细胞，以使其获得顺铂耐药表型，并对基质细胞CAF进行重编程。PKM2催化糖酵解的最后一步，是一种限速酶。近年来，越来越多的证据表明PKM2的活性与肿瘤的发生发展密切相关；然而，很少有人关注富含PKM2的外泌体在非小细胞肺癌中的作用。我们的结果表明hCRexo可以通过PKM2依赖的机制转移对顺铂的耐药性；此外，我们还观察到在低氧条件下，PKM2在外泌体中的含量增加，表明外泌体PKM2蛋白能直接转移到其它肿瘤细胞中，从而影响肿瘤细胞的恶性表型。顺铂耐药细胞中PKM2的高表达增加了PKM2蛋白和下游代谢产物（如乳酸和丙酮酸）的产生和分泌，而乳酸和丙酮酸又能增加细胞对化疗药物的耐药性，然而，蛋白质和代谢产物在细胞外环境中不稳定，容易分解。我们认为蛋白质或代谢产物对受体细胞的作用缺乏持续性，这可能不是导致化疗耐药的主要途径。由于脂质双分子层的覆盖，外泌体具有天然的内容物保护特性，并持续将来自顺铂耐药细胞的PKM2传递给敏感细胞，这可能是耐药细胞和敏感细胞之间信号转导的主要方式。ROS的积累能破坏线粒体外膜，导致细胞凋亡。最近的研究表明，体细胞将糖酵解产物转至磷酸戊糖途径(PPP)，以产生NADPH，从而中和ROS。在以前的研究中，我们发现缺氧诱导的胞外体PKM2促进糖酵解产生还原性代谢产物，这可能中和了顺铂诱导的活性氧(ROS)。据报道，PKM2通过磷酸化BCL2的T69位，继而稳定BCL2、抑制氧化应激诱导的细胞凋亡。与以前的报道一致，我们发现外泌体PKM2在氧化应激下也能被转运到线粒体，使BCL2磷酸化，从而减少顺铂诱导的细胞凋亡。PKM2除了在肿瘤细胞中发挥作用外，还可能通过外泌体影响肿瘤微环境、加速癌变，例如，来自骨髓的前列腺癌外泌体PKM2通过上调骨髓基质细胞中的CXCL12的表达来促进转移。另一项研究表明，外体PKM2诱导单核细胞向巨噬细胞分化，并重塑肿瘤微环境以促进肝细胞癌的进展。本文首次发现外泌体PKM2诱导CAF代谢重编程，导致NSCLC细胞耐药。近年来，研究表明肿瘤相关成纤维细胞(CAF)分泌的外泌体可以调节肿瘤的微环境，例如由CAFs-exo分泌的lncRNA H19可以促进结直肠癌的干性和化疗耐药性；CAFs来源的外泌体中的miR-522促进胃癌获得性化疗耐药等；然而，我们研究的重点是耐药肿瘤细胞分泌的外泌体是否对肿瘤微环境(如CAFs)的代谢状态进行了重新编程：CAFs向肿瘤细胞分泌乳酸和丙酮酸，从而增强了CAFs与肿瘤细胞的代谢联系。在本研究中，我们揭示了低氧诱导的NSCLC细胞PKM2外泌体能传递顺铂耐药性，外泌体PKM2可能能成为NSCLC顺铂耐药的一个标志物和治疗靶点，然而，本研究也存在一定的局限性。在我们的研究中，缺乏足够的临床样本来充分证明外泌体PKM2的高表达与顺铂耐药之间的相关性，由于我们发现肿瘤缺氧区域的顺铂耐药细胞中PKM2的表达明显高于正常肿瘤细胞，并有一定的临床证据，我们认为外泌体PKM2可能是一个潜在的能预测肿瘤细胞凋亡的生物标志物，虽然PKM2在顺铂耐药肿瘤中高表达，但在正常肿瘤组织中也有广泛表达。鉴于人体内表达和修饰的复杂性，这些研究成果距离临床应用，还有很长的路要走。
该研究提出了一种细胞耐药性在实体瘤中传递的新机制。低氧诱导的外泌体通过PKM2依赖性机制和CAFs重新编程来创造耐药微环境，直接传递耐药性。外泌体PKM2可能是临床检测顺铂耐药非小细胞肺癌的潜在生物标志物，这也能为这些顺铂耐药的非小细胞肺癌患者提供新的PKM2的靶向治疗策略。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33456577/
