编译:晨晨,编辑:Emma、江舜尧。
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导读
IVa型菌毛是一种广泛存在且功能多样的细菌细胞表面丝状结构,在四型菌毛装置(T4aPM)的驱动下进行周期性的伸展、粘连和收缩。T4aPM的整体结构和10个保守的核心蛋白已被阐明。本研究利用遗传学、细胞生物学、蛋白质组学和低温电子断层扫描技术,证明了PilY1和广泛存在于T4aP系统中的四个次要菌毛蛋白形成的复合物是T4aPM的组成部分,且对Myxococcusxanthus菌毛的扩展至关重要。此外,这些蛋白是菌毛的一部分。研究数据支持一个模型:PilY1/次要菌毛复合体位于菌毛粘着的复合体尖端,能启发T4aPM中菌毛伸张,通过终止收缩来维持下一轮的伸展。
原名:PilY1 and minor pilins form a complexpriming the type IVa pilus in Myxococcus xanthus译名:PilY1和次要菌毛形成复合物,启动黄色粘球菌的IVA型菌毛通讯作者:LotteSøgaard-Andersen
1. PilY1和次要菌毛的缺失阻碍了菌毛伸缩
在M. xanthus的前期研究中,鉴定到三个基因簇编码次生菌毛蛋白。本文进一步分析表明这三个簇各编码一个PilY1蛋白和四个次要菌毛蛋白(FimU, PilV, PilW, PilX;图1b)。主要菌毛蛋白PilA和12个次生菌毛蛋白都含有III型信号肽。M. xanthus的三个PilX与P.aeruginosa、N. gonorrhoeae的相似,都不含有保守的Glu5位点。所有13个成熟的菌毛蛋白中都预测含有N-端α-螺旋。
M. xanthus的PilY1都含有I型信号肽,说明都能穿过内膜到达周质,这三个蛋白C-末端都含有保守的PilY1结构域。基于P. aeruginosa的PilY1结构域,可以对M. xanthus三个PilY1蛋白建模。与P.aeruginosa PilY1相似,PilY1.3包含一个N端vWFA结构域,基于Catenulisporaacidiphila中Caci_2163的vWFA结构域可以建立同源模型。与N.gonorrhoeae PilY1类似,PilY1.1和PilY1.2在N端不具有结构域。因为M. xanthus有单个主要菌毛,这些分析提示有12个次要菌毛和3个PilY1蛋白可能与1个主要菌毛及T4aPM共同发挥功能。
基因簇缺失实验结果表明,基因簇1和3可以发挥T4aP依赖的运动功能(图1c)、指导T4aP的形成(图1d)。在这两个簇中,PilY1和次要菌毛蛋白对于T4aP依赖的运动性(图1c)和T4aP的形成(图1d)是必不可少的。在4个无菌毛的三重缺失突变体中,进一步敲除pilT基因不能恢复T4aP的形成(图1e)。因此,缺少次要菌毛或PilY1导致T4aP延伸缺陷,而不是过度收缩。四个三缺失突变体都含有T4aPM的十个核心蛋白(图1f),表明核心蛋白之间具有相互作用。在杆状M. xanthus细胞中,T4aPMs特异性地定位在细胞两极,这种组装依赖于M. xanthus细胞外膜中的PilQ。PilM-mCherry的定位表明T4aPM位于细胞两极(图1a),但在ΔpilQ中,PilM-mCherry不定位在细胞两极。总之,缺少次要菌毛蛋白或PilY1阻止了菌毛伸缩但不影响T4aPM的组装。
此外,研究人员使用LFQ-MS对全细胞提取物中的次要菌毛和PilY1进行了定量。检测到T4aPM的10个核心蛋白,簇3所有的蛋白,簇1上的2-5个蛋白,未检测到簇2编码蛋白。绝对量化表明PilA是M.xanthus中含量最高的蛋白质之一,而簇3和簇1蛋白的含量比P. aeruginosa次要菌毛蛋白含量低。因为簇3蛋白质在野生型细胞中含量多且在控制着T4aP的形成和功能中起主要作用,因此对簇3蛋白进行了重点研究。
在Δ1Δ2中,簇3基因的缺失和回补实验表明,pilV3、pilW3、pilX3和pilY1.3对于T4aP依赖的运动和伸张是不可缺少的。而ΔfimU3缺失PilT时,T4aP扩展功能并没有完全缺失。
图1. PilY1和次要菌毛蛋白对于T4aP依赖的运动是不可缺少的
a. T4aPM的结构示意图。b. M. xanthus编码PilY1和次生菌毛蛋白的基因簇图。c. PilY1和次要菌毛蛋白对于T4aP依赖的运动是不可缺少的。d. PilY1和次要菌毛蛋白对于依赖于T4aP的形成是不可缺少的。e. PilY1和次要菌毛蛋白对于依赖于T4aP的伸展是不可缺少的。f. T4aPM蛋白含量。g. T4aPM的组分mCherry-PilM在细胞两极的定位。
2. 主要菌毛和次要菌毛的互作
使用细菌双杂交(BACTH)检测PilA和簇3中不含有III型信号肽的次要菌毛蛋白是否发生互作。将腺苷酸环化酶的T18和T25片段与PilA的N端融合。结果表明,PilA和FimU3,PilV3,PilW3,PilX3之间有强互作(图2a)。FimU3,PilW3,PilX3和PilA有强互作,而PilV3与PilA的互作关系弱(图2a)。在分离实验中,观测到所有的6个融合蛋白在细胞膜中富集(图2b)。T18-PilV在剩余组分中积累量低,说明可能与次要菌毛不发生互作,与PilA互作关系较弱(图2a)。缺少N-端α-螺旋的pilA与T18融合后能锚定在内膜上,不与次生菌毛互作,在膜中的含量不高。总之,结果表明,PilA与次要菌毛发生互作。
图2. PilA和簇3的次要菌毛蛋白互作
a. BACTH分析PilA和簇3的次要菌毛蛋白互作。T25和T18融合在成熟蛋白的N端。左图:E.coliBTH101细胞表达蛋白互作图。中间图:β-半乳糖苷酶活性。右图:互作结构示意图。b. E. coliBTH101表达蛋白。(S)表示可溶性蛋白,(M)表示细胞膜蛋白裂解物。
3. PilY1和次要菌毛蛋白互作
用pull-down结合质谱检测了PilY1.3和簇3上的菌毛蛋白的互作。使用FLAG标记PilY1.3后,细胞仍能运动,说明加入标签后不影响PilY1.3与T4aPM组分的互作(图3a,b)。富集到三个次要菌毛蛋白(PilX3、PilW3、FimU3)和T4aPM核心蛋白PilO(图3c)。总之,BATCH实验和PilY1.3-FLAG pull-down分析表明PilY1.3能与簇3上的次要菌毛蛋白互作,次要菌毛蛋白能与PilA互作。如果PilY1.3和次要菌毛蛋白是T4aPM的组成部分,则二者也位于M. xanthus细胞极端。为验证这一假设,在Δ1Δ2ΔpilY1.3突变体中表达pilY1.3-sfGFP,Δ1Δ2ΔpilW3突变体中表达pilW3-sfGFP,二者不具备运动功能,但能在细胞中积累。97%的细胞中含有极端定位的PilY1.3-sfGFP、86%的细胞中含有极端定位的PilW3-sfGFP。二者定位依赖于T4aPM组装所需的PilQ(图3f),说明T4aPM中整合了PilY1.3-sfGFP和PilW3-sfGFP。如果次要菌毛蛋白和PilY1.3直接互作,它们可能相互依赖或嵌入到T4aPM。在簇3的四个次要菌毛都缺失的情况下, PilY1.3-sfGFP不能累积(图3 d)。然而,PilY1.3-sfGFP在缺失FimU3, PilV3或PilW3菌株中积累,但不存在于缺乏PilX3的菌株中(图3d)。在前三个菌株中,PilY1.3-sfGFP的极端定位显著降低(图3f)。同样,在缺少PilY1.3的情况下,PilW3-sfGFP的积累显著减少且不能极端定位(图3e, f)。在缺乏PilA时,PilY1.3-sfGFP和PilW3-sfGFP发生极端定位 (图3d-f),说明在不依赖于PilA的情况下,二者整合到T4aPM。利用pull-down检测了PilY1.3-sfGFP、PilW3-sfGFP与T4aPM组分的互作。利用PilY1.3-sfGFP富集到PilX3、PilW3、FimU3和核心蛋白TsaP,利用PilW3-sfGFP富集到PilY1.3、PilX3、PilO和PilB(Fig. 3h),说明次生菌毛和PilY1.3、T4aPM发生直接互作。总之,结果表明:(1)PilY1.3和PilW3、簇3上的一些次要菌毛蛋白整合到T4aPM中(2)次要菌毛蛋白和PilY1.3都与T4aPM互作(3)它们在T4aPM的整合不依赖于PilA。此外PilY1.3-sfGFP和PilW3-sfGFP都整合在T4aPM中。
图3.簇3次生菌毛蛋白与PilY1.3互作
a.在PilY1.3或PilW3加上标签后的依赖于T4aP的运动。b. PilY1.3-FLAG和GFP-FLAG的累积含量。c. 簇3次生菌毛蛋白与PilY1.3互作。点代表相应的数值; n.d.代表PilY1.3-FLAG样品中未检测到. d, e. PilY1.3-sfGFP和PilW3-sfGFP的累积量。f. PilY1.3-sfGFP和PilW3-sfGFP在细胞两极的定位。g. PilY1.3-sfGFP与簇3次生菌毛蛋白互作。h. PilW3-sfGFP与簇3次生菌毛蛋白互作。
4.PilY1和次要菌毛形成启动复合物T4aPM
使用cryo-ET观察T4aPM中次要菌毛蛋白和PilY1的位置。Δ1Δ2Δ3pilY1缺少3个PilY1蛋白,其T4aPM结构不具有菌毛蛋白,该突变体缺少大多的短茎结构且中周质环蛋白密度低(图4a,第二列)。在ΔpilA、Δ1Δ2Δ3fimUpilVpilW 突变体中也不存在PilN和PilO球状结构域组成的周质环 (图4a,第3、4列)。与Δ1Δ2Δ3pilY1突变体相似,Δ9次要菌毛蛋白突变体缺少大多数短茎和栓密度(图4a,第4列)。相比之下,ΔpilA缺少短茎的下部分,这一观测结果与PilA、次生菌毛蛋白和PilY1占据短茎和栓相一致。因为ΔpilA的T4aPM整合了剩余的核心蛋白、次生菌毛、和PilY1.3-sfGFP(图3f),这些数据表明PilA位于短茎下半部分,而次生菌毛蛋白和PilY1.3位于上半部分。因为次生菌毛蛋白和PilY1.3相互依赖并嵌入在T4aPM中,它们的排列并不清楚。为了定位,考虑到PilY1.3与次生菌毛蛋白互作,次生菌毛蛋白与PilA互作。首先假设次生菌毛蛋白位于PilA的上面,PilY1组成了栓。然而,栓的大小不足够容纳整个PilY1.3蛋白,因此不可能有这种排列。接下来,我们考虑到PilY1.3能与PilO互作,因为PilY1.3含有两个球形结构域,即N-端vWFA域和C-端PilY1域,因此假设PilY1.3的一个结构域占据短茎的上部分,与周质环的下面相邻;而另一个结构域能解释栓密度。为验证该假设,在Δ1Δ2中分别表达PilY1.3或PilY1.3-GFP,PilY1.3-sfGFP嵌入到T4aPM中但能阻止T4aP的延伸(图3 a、f)。然后我们比较了含有PilY1.3和PilY1.3- sfgfp的菌株的T4aPM,发现后者平均值(图4a,第五列)与WT的平均值基本相同(图4a,第一列)。这与簇3蛋白在WT细胞中占主导地位相一致。与预期结果一致,我们只在SA7791的细胞中观察到无菌毛的T4aPM(图4a,第六列)。更重要的是,该菌株不含有短茎和栓,且在短茎顶端含有sfGFP密度,与PilN和PilO组成的周质环接近,并且sfGFP标签被融合到PilY1.3的C端,这些数据说明PilY1.3的PilY1结构域位于T4aPM短茎的尖端,保守性低的N端结构域可以解释PilQ附近的栓密度。为了更精确地确定T4aPM中PilY1.3的位置,我们分析了PilY1.3ΔvWFA、PilY1.3ΔvWFA-FLAG、PilY1.3ΔvWFA-sfGFP。两个蛋白在Δ1Δ2中积累,但T4aP依赖的运动能力缺失(图3 a)。PilY1.3ΔvWFA-sfGFP在84%的细胞中发生极端定位,且定位依赖于PliQ。为鉴定PilY1.3ΔvWFA的互作蛋白,进行了PilY1.3ΔvWFA-FLAG pull-down实验,富集到三个次生菌毛蛋白(PilX3, PilW3, and FimU3)和核心蛋白PilO。使用全长 PilY1.3-FLAG也富集到这四个蛋白(图3 c),说明PilY1的C-端结构域与这四个蛋白互作,该结构域位于周质环的低区域。PilY1.3ΔvWFA-FLAG 中只能检测到无菌毛的T4aPM结构。图4a中T4aPM缺少短茎和栓密度,但周质环完整无缺,因为周质环依赖于PilA、次生菌毛蛋白和(图4a、第2、3、4列),所以说PilA、次生菌毛蛋白和PilY1.3ΔvWFAFLAG整合在T4aPM中。我们推测PilY1.3的vWFA域可能与PilA、次生菌毛蛋白和PilY1.3在T4aPM的整合和稳定性有关。总之,这些结果与次生菌毛蛋白和PilY1.3是无菌毛T4aPM组成的模型相一致。且支持以下观点:(1)PilQ对次生菌毛蛋白和PilY1.3 整合到T4aPM是必不可少的,但是对于这些蛋白的稳定性不起作用。(2)PilA对次生菌毛蛋白和PilY1.3整合到T4aPM并非所需。(3)次生菌毛蛋白和PilY1.3整合到T4aPM具有稳定性上的相互依赖。因为缺少PilB时,短茎和栓是T4aPM的一部分,推测其是无菌毛T4aPM的完整部分。ΔpilA的T4aPM中,短茎和内膜之间具有间隙,说明在缺少PilA时(图4a,第3列),次生菌毛蛋白之间可能不能正确互作。它们的随机定位引起了短茎下部分的平均密度降低。因为T4aP的延伸需要PilY1和次生菌毛蛋白,这些数据支持了短茎和栓密度是T4aP引发复合体的假设(图 4b,左图)。对启动复合物模型中PilA、次生菌毛蛋白和PilY1的排列进一步进行实验,利用同源蛋白的现有结构信息和簇3蛋白产生一个假设模型。使用M. xanthus FimU3、PilV3、PilW3、PilX3和PilA的球状结构同源模型替换N. gonorrhoeaeT4aP的五个主要的菌毛蛋白。在BACTH实验中,PilV3只与PilA互作,在PilY1.3和PilW3 pull-down实验中未检测到PilV3,但它对纤毛的形成至关重要。因此,假设PilV3位于PilA和启动复合体其余的组分之间。PilX3是PilY1.3-FLAG下拉的含量最多的蛋白,我们把PilX3放在5个亚单位的最上面。因为PilW3-sfGFP能下拉PilX3,我们将PilW3放置在PilX3下面,FimU3紧随其后。接下来,我们分别对PilY1.3的vWFA的结构域和PilY1结构域进行建模,并将PilY1与PilA/次生菌毛蛋白复合体相关联。这种假设模型支持了T4aPM中组分排列的可行性。然而,菌毛球形结构域的精确结构、顺序和包装,以及蛋白间的计量还需要进一步的实验验证。
图4. PilA、次要菌毛蛋白和PilY1组成了短茎和栓
a.不同基因型菌株中T4aPM的结构。上行,T4aPM通过亚断层的中央切片。下行表示不同基因型的蛋白密度。b.T4aPM复合体模型。左图,无菌毛的T4aPM组分图,PilB和PilT没有分别表示(为简化)。右图,3-nm的假设结构模型。
5.PilY1和次要菌毛蛋白存在于T4aP中
因为启动复合体可以作为PilA整合到菌毛中的支架,预测启动复合体可能不存在于T4aPM和伸张菌毛的顶部。为检测PilY1.3和次生菌毛是否嵌入到菌毛中,对T4aP进行纯化并对其互作蛋白进行定量。实验表明,T4aP互作的蛋白中含有大量的PilA、簇3的3个次生蛋白和PilY1.3,不含有T4aPM的其它蛋白。簇3次生蛋白和PilY1.3的含量相似,说明它们作为一个复合体存在于T4aP中(图5b)。纯化的菌毛中,PilY1-次生菌毛蛋白与PilA的比例为0.5–2.0:10,000(图5b)。因为10μm长的菌毛中含有约10,000 PilA亚单位,M.xanthusT4aP典型长度为2–6μm,分子比例也表明T4aP菌毛含有单个的PilY1.3/次生菌毛蛋白复合体。我们观测到在纯化的菌毛中存在PilV3,说明PilV3也是PilY1.3/次生菌毛蛋白复合体的一部分。为了查找PilY1.3/次生蛋白复合体的可能位置,使用免疫金和透射电镜对修剪的T4aP和表达PilY1.3-FLAG的细胞进行观察。在修剪的T4aP中,检测到菌毛相关的金颗粒。在每个菌毛上有多个金颗粒,这与PilY1.3存在于延伸菌毛中相一致。对T4aP进行了从细胞包被到菌毛尖端的追踪,鉴定到43个菌毛蛋白,其中,72%的具有特异性高、密度低和尖端弯曲的特点。我们也推测PilY1.3能够在菌毛尖端形成弯曲结构。弯曲结构的平均大小与PilY1.3的vWFA域相一致,可以作为T4aPM的栓密度(直径约4nm)(图5c iii)。更有意思的是,在一些弯曲的尖端结构中有明显的球形密度,它通过较轻的密度轴连接到菌毛的顶端(图5civ)。球状密度的大小与菌毛尖端与T4aPM栓的距离相一致。观察结果与菌毛的弯曲结构观点一致:菌毛的结构可能代表着启动复合体,其中PilY1.3的C-端位于弯曲末端、N-端vWFA域在最终尖端。30%的菌毛尖端没有明显的弯曲,其中一个可能的原因是冻结时柔韧的顶端与菌毛轴恰好发生对齐。总之,研究结果表明PilY1、4个次生菌毛蛋白和主要菌毛蛋白PilA形成引发复合体,该复合体对于T4aP的延伸是必须的。在无菌毛的T4aPM中,该复合体包含短茎结构和栓,它在组装T4aPM时嵌入在一起(图6)。因为T4aPM可以执行菌毛的多次延伸和收缩,在野生型无菌毛的T4aPM中的短茎和栓密度一致,说明启动复合体在菌毛收缩后仍能保持完整。因此推测尖端复合体像木塞一样阻止菌毛完全收缩到内膜(图6)。这一停止收缩机制可能涉及到PilY1.3 N-端vWFA域、中间的周质环、PilW3的球形结构域、FimU3以及PilY1.3的C-端。另一种可能的机制是启动复合物中次生菌毛蛋白的N端螺旋排列不规范,这是由于不同的球状结构域的堆积、或与PilY1结合造成的。启动复合体N-端非典型的α-螺旋可能是由于球形结构域的组装引起的。同源T2SS支持次生菌毛是启动复合体的一部分的观点。该系统包括4个小的假菌毛蛋白和1个大的假菌毛蛋白,分别是次要菌毛蛋白和主要菌毛蛋白的同源物,并组装形成一个假蛋白通过T2SS转运到外膜。小的假蛋白GspK位于假菌毛末端并于T2SS底物互作。GspK与PilX相似,缺少保守的Glu5残基。PilX位于复合体的尖端并于PilY1.3互作,说明PiY1.3是T2SS的底物类似物。PilY1的N-端结构域位于菌毛尖端,解释了PilY1与宿主侵染过程的特异性有关。推测M. xanthus三个基因簇分别提供T4aP不同的特性,从而识别不同的底物。与M. xanthus的PilY1.3、Legionellapneumophila的PilY1相似,P. aeruginosa PilY1的N-端vWFA结构域感应剪切力后可能发生构象改变,从而发生表明粘附。最后,I型菌毛由外膜引导蛋白在外膜组装,而III型分泌系统的针尖是在针的组装完成后加上的。因此,细菌至少有三种不同的产生纤毛表面结构的机制。
a. T4aP中富含PilY1和次要菌毛蛋白。T4aP来自于多菌毛ΔpilT突变体和无菌毛的ΔpilBΔpilT(阴性对照)。b. iBAQ值为ΔpilT的iBAQ值去除阴性对照。c. T4aP的冷冻电子断层扫描图。双箭头表示长、宽和角度。
图6. PilY1/次生菌毛蛋白复合体的三个功能
左图,无菌毛的T4aPM结构示意图,含有10个核心蛋白,复合体由PilY1、4个次要菌毛蛋白和1个PilA亚单位组成。右图,含有菌毛的T4aPM结构示意图,含有10个核心蛋白,菌毛伸张和收缩时,PilB和PilT与PilC发生特异性互作。
原文链接: https://doi.org/10.1038/s41467-020-18803-z