科研| MOL NUTR FOOD RES：葡萄提取物通过调节肠道微生态系统和胆汁酸等途径激活棕色脂肪组织（国人佳作）
编译：豆几，编辑：谢衣、江舜尧。
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肥胖是体内脂肪过度堆积导致的，常常伴随多种疾病的高风险，例如心血管疾病、糖尿病、慢性肾炎和多种癌症等；体内脂肪又分为白色脂肪和棕色脂肪，激活的棕色脂肪组织可以燃烧大量葡萄糖和脂质产生热量，正是这一特性，棕色脂肪组织的激活被认为有利于抵抗肥胖。研究人员以赤霞珠葡萄提取物（GE）为研究对象，利用高脂小鼠模型评价GE抵抗肥胖和缓解炎症的功效，结果表明GE能够抑制高脂小鼠的体重增长，减少脂肪堆积，改善葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，增加能量代谢和缓解炎症。研究人员进一步从肠道微生态系统和胆汁酸代谢的角度系统探究了GE抵抗肥胖的机制，结果表明GE能够恢复由于高脂饮食导致的肠道微生态紊乱，在属水平上增加Bifidobacteria, Akkermansia和Clostridia 菌的丰度，并且改变血清中胆汁酸水平，发现肠道微生态系统与胆汁酸水平具有相关性。最后，研究人员以胆汁酸受体TGR5为靶点，通过细胞模型和动物模型研究GE激活棕色脂肪组织的机制，结果发现GE促进血清中DCA含量升高，DCA能够通过调控TGR5-D2-UCP1途径刺激棕色脂肪组织激活。但是，本研究发现GE的初级代谢产物-小分子酚酸不能在细胞模型中对TGR5产生影响。本研究揭示了膳食多酚的效应机制是通过改善肠道微生态系统来影响胆汁酸水平，从而促进了棕色脂肪组织激活。
论文ID
原名：Grape extract activates brown adipose tissue through pathway involving the regulation of gut microbiota and bile acid
译名：葡萄提取物通过调节肠道微生态系统和胆汁酸等途径激活棕色脂肪组织
期刊：Molecular Nutrition & Food Research
IF：4.653
发表时间：2020.04
通讯作者：游义琳， 战吉宬，黄卫东
通讯作者单位：中国农业大学食品科学与营养工程学院
实验设计
本文旨在研究葡萄提取物（GE）作为膳食干预剂，对代谢、激活棕色脂肪组织和肠道微生态系统的影响和探索相互之间的相关性。研究人员首先使用4周龄的C57BL/6Cnc雄性小鼠，通过饲喂高脂饲料建立高脂小鼠模型（HFFD），外加在饮水中添加1% GE进行膳食干预(HFFD+GE)。通过分析小鼠体重、脏器组织重量、脂肪和肝脏组织切片、血清中葡萄糖和胆固醇含量、葡萄糖耐量和胰岛素抵抗试验，评价GE抵抗肥胖的效果和对葡萄糖稳态的影响。然后，监测小鼠饮食摄入量、能量摄入量、能量吸收量、能量消耗量、运动量、氧气消耗量和二氧化碳排放量，通过分析数据评价GE对小鼠能量代谢的影响。通过ELISA检测小鼠血清中炎症因子的含量，qPCR检测小鼠白色脂肪组织和肝脏中炎症因子的转录水平，肝脏组织切片结果的分析，评价GE对小鼠炎症的影响。接着，对小鼠盲肠中的粪便样品进行16S rRNA高通量测序分析肠道微生态系统（GM），评价GE对肠道微生态系统的影响。运用UPLC/ESI-MS检测小鼠血清样品中胆汁酸（BA）的种类和含量，评价GE对小鼠BA代谢的影响，并联合肠道微生态数据进行Spearman相关性分析。随后，研究人员对小鼠棕色脂肪组织（BAT）展开研究，使用qPCR检测相关的基因转录水平，使用免疫组化组织切片观察UCP1 和 TGR5蛋白，使用Western Blot分析TGR5, D2和UCP1蛋白，使用透射电镜观察BAT并计算线粒体的相对数量，测定线粒体DNA拷贝数量。最后，研究人员在体内试验和细胞试验中分析GE的代谢物和棕色脂肪之间的相关性。通过对4周龄的C57BL/6Cnc雄性小鼠按剂量2.5g/kg·BW灌胃GE，收集血清后通过UPLC检测血清中的酚酸类物质。通过构建棕色脂肪细胞模型，使用GE的代谢物处理细胞后，使用qPCR检测UCP1 和TGR5蛋白的转录水平。
实验结果
1. 在高脂动物模型中GE能够抵抗肥胖并且提升葡萄糖稳态
从第7周开始，GE作为膳食干预剂能够显著抵抗高脂小鼠由于饲喂高脂饲料引起的体重增加，GE干预组小鼠体重比HFFD组轻15.12%（图1A）。体重下降的一部分原因是因为小鼠脂肪组织的减少，包括白色脂肪组织的减少和肝脏重量的降低（图1B），一部分原因是与脂肪细胞的减小和肝脏中脂肪含量的减少有关（图1C）。然而，三组小鼠的饮食和饮水摄入量并没有显著性差异（图1D）。在GE的摄入干预下，小鼠血清中的葡萄糖和胆固醇含量能够恢复到正常水平（图1E）。小鼠在注射葡萄糖后，GE干预组的小鼠显示出更强的葡萄糖抵抗能力（图1F和1G），并且能够提升胰岛素的敏感性（图1H和1I）。因此，基于上述结果认为GE的摄入能够抵抗小鼠由于饲喂高脂饲料导致的肥胖，并且能够提高胰岛素的敏感性。
2. GE能够增强能量代谢和减轻炎症
由于肥胖和能量消耗密切相关，因此研究GE在能量代谢方面的作用。发现HFFD组和GE干预组的小鼠，在饮食、饮水摄入量方面不存在显著性差异（图2A），在能量摄入量和能量吸收量方面也不存在显著性差异（图2B和2C）。GE干预组的小鼠显示出更高的氧气消耗量和二氧化碳释放量（图2D-H），而在活动量方面和HFFD组小鼠之间不存在显著性差异（图2I）。基于上述结果，认为GE是通过增加能量消耗量来抵抗肥胖。
当患有肥胖和二型糖尿病时，机体的免疫系统会发生变化，最明显的变化是在脂肪组织、肝脏和白细胞中发生炎症。因此，研究人员测定了血清、腹部白色脂肪组织和肝脏中的炎症因子。发现GE干预组的血清样品中，IL-6、TNA-α和LPS的含量下降（图2J）。发现GE干预组腹部白色脂肪组织和肝脏组织的样品中，IL-6、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的转录水平下降（图2K和2L）。在GE干预组的肝脏样品切片中，发现摄入GE能够减少肝脏脂肪的积累和减轻淋巴细胞的的局灶性浸润（图2M）。上述结果说明GE的膳食干预能够减轻由于高脂饲料摄入导致的炎症。
3. 在高脂饲料饲喂的小鼠中，GE的补充恢复了肠道微生态系统的紊乱
通过16S rDNA测序分析盲肠粪便样品的肠道微生态系统。图3A展示的结果说明测序质量是合格的，能够满足后续数据分析。HFFD组小鼠的测序结果显示在门水平上拟杆菌门和变形杆菌门的相对丰度上升，GE干预组小鼠中门水平上这两类菌的相对丰度趋向正常，同时还使疣微菌门的相对丰度上升。GE干预组小鼠粪便样品中厚壁菌门/拟杆菌门的比例更高（图3B和C），而且具有更高的菌群多样性和丰度（图3E-H）。根据主坐标分析和主成分分析发现GE干预组的菌群结构更加接近标准饲料组的小鼠菌群结构，和HFFD组小鼠差异明显。（图3I-J）。在主成分分析图中显示，HFFD组的样品更加集中，可以认为高脂饲料对肠道微生态系统产生一种选择压力，促使肠道菌群结构向着一个相同的方向靠近，而GE的干预减轻了这种选择压力（图3I-J）。根据LEfSe分析，发现在属水平上Bacteroides和Desulfovibrio是GE干预组中下降最多的菌属，这个趋势和门水平上是一致的（图3K）。总体而言，GE的干预能够恢复由于高脂饲料导致的肠道微生态系统紊乱。
4. GE的补充能够改变胆汁酸水平，并与肠道微生态系统具有相关性
肠道微生态系统是影响各种胆汁酸转变的重要因素，而胆汁酸是影响哺乳动物能量代谢的关键因素。本研究想要确定GE干预后的肠道微生态系统是否能够影响小鼠血清中的胆汁酸水平，是否可以影响胆汁酸的代谢？结果发现饲喂高脂饲料会导致胆汁酸含量的升高，而GE的干预能够显著降低胆汁酸含量，主要影响的是结合型胆汁酸，例如TαMCA和TβMCA（图4A）。同时，结果发现GE干预组的小鼠血清中TCA，TUDCA和THDCA的相对含量出现下降，DCA的相对含量却升高了（图4B）。GE的干预导致游离型胆汁酸/结合型胆汁酸和次级胆汁酸/初级胆汁酸比例的升高，这个结果说明GE的干预可以通过肠道微生态系统促进胆汁酸的降解（图4C）。虽然没有研究证明Akkermansia菌具有分泌胆盐水解酶（BSH）的能力，但是从结果中发现Akkermansia菌和胆汁酸之间存在相关性。运用Spearman相关性分析分析肠道微生态系统和胆汁酸之间的相关性，结果发现Akkermansia, Clostridium 和Bifidobacterium的丰度与TαMCA, TβMCA 和TCA的浓度之间存在负相关，却与DCA的浓度之间存在正相关（图4D-F）。上述结果说明Akkermansia, Clostridium 和Bifidobacterium三种菌可能具有降解胆汁酸的能力。因此，研究人员认为GE的干预改变了血清中的胆汁酸组成和含量，而这种改变可能和肠道微生态系统存在部分的相关性。
图4 GE的摄入改变了胆汁酸的含量和组成，并且这种改变与肠道微生态系统有相关性。（A和B）血清中胆汁酸的含量和相对含量（n=5）。（C）结合型胆汁酸和游离型胆汁酸的比例（n=5）。通过Spearman相关性分析来分析Akkermansia(D)，Clostridium(E)，Bifidobacterium (F)和胆汁酸的相关性（n=5）。
5. GE的补充通过上调TGR5来刺激棕色脂肪组织激活产生热量
上述实验结果说明，GE的干预能够通过增加能量消耗来抵抗肥胖，同时能够通过改变肠道微生态系统结构来改变血清中胆汁酸水平。因为棕色脂肪组织是机体产生热量的重要场所，同时能够调节胆汁酸水平。考虑到棕色脂肪组织的作用，研究人员下一步研究GE是否能够对棕色脂肪组织产生积极的影响。TGR5是一种胆汁酸的特异性受体，能够调通过控制棕色脂肪组织中的下游基因D2来调控产热作用相关基因UCP1和PRDM16。鹅去氧胆酸（CDCA），DCA和石胆酸（LCA）是TGR5的天然刺激剂。实验发现GE干预组小鼠血清中DCA的含量显著升高（图4A），TGR5、UCP1的转录水平和蛋白水平均显著升高（图5A-C），同时发现PRDM16、D2的转录水平也升高了（图5A）。上述结果说明GE的干预能够激活TGR5-D2的产热作用相关基因。根据小鼠在4度环境中的体温监控结果，发现GE的干预能够显著增强产热作用（图5D）。通过PET-CT照片的结果，能够发现GE的干预能够增加葡萄糖的吸收（图5E）。
脂肪酸是棕色脂肪组织发挥产热作用的最初燃料来源。通过分析基因PGCAα，PGC1β，MCAD，PPARα和ATGL转录水平的变化，发现GE的干预能够加速脂肪酸的氧化。同时，发现GE的干预能够增加线粒体的相对数量和线粒体DNA的拷贝数量，并且上调线粒体合成基因TAM和NRF2（图5G-J）。总体而言，在高脂小鼠模型中，GE的干预能够改变胆汁酸水平，通过影响胆汁酸受体TGR5从而影响了棕色脂肪组织的产热作用。
6. 在体外试验中，GE的代谢物不能显著影响TGR5的转录水平
根据已有研究，血清中的小分子酚酸是GE的初级代谢产物。本研究想要确定GE的初级代谢产物-小分子酚酸是否能够直接激活TGR5？研究人员发现在补充GE的小鼠血清中GA，PCA，HPA和CA显著提高（图6A-E）。然后，研究人员通过小鼠鼠胚胎成纤维细胞进一步分化构建了成熟的棕色脂肪细胞，在该细胞模型中，使用单一的小分子酚酸或者是上述小分子酚酸的混合物进行实验。结果表明，GA，CA，VA和小分子酚酸的混合物能够上调UCP1基因的转录水平（图6F），但是TGR5基因转录水平没有显著变化。这说明一定浓度的GE的初级代谢产物-小分子酚酸不能影响TGR5。
讨论
本研究旨在研究GE在抵抗肥胖和代谢紊乱方面的积极作用和相应机制。在高脂小鼠模型中，GE的干预能够抵抗小鼠体重的增加，减少脂肪的累积，提高胰岛素敏感性，并且降低系统性炎症，这些活性主要是由于GE能够促进能量消耗。同时，GE的干预能够部分恢复由于高脂饲料导致的肠道微生态系统紊乱，并且显著增加Bifidobacterium 和Clostridia菌的相对丰度。GE的干预能够通过影响肠道微生态系统间接影响血清中的胆汁酸水平，根据相关性分析发现Bifidobacterium 和Clostridia菌和DCA存在正相关。而且，胆汁酸的变化能够刺激棕色脂肪组织激活产热，DCA具有更显著的作用效果。研究人员进一步探究发现，在棕色脂肪细胞模型中，TGR5的转录水平并不能被GE的代谢物影响。但是，GE影响肠道微生态系统和胆汁酸水平的机制仍然不清楚。本研究为膳食多酚的研究提供了一个新的视角。
本研究使用的GE的剂量能够为制定人体饮食摄入量提供参考。之前的研究发现，在高脂饲料喂养导致肥胖的小鼠模型中，补充C3G，芦丁和VA作为膳食干预剂能够抵抗小鼠肥胖。和其他研究进行对比发现，在饮水中添加1%C3G能够降低17.8%的小鼠体重，但是该研究中使用的剂量高于单一多酚的每日推荐摄入量。在本研究中，在饮水中添加1%GE能够降低15.8%的小鼠体重，GE的使用剂量是405 mg/kg BW，是符合多酚每日推荐摄入量的。
许多研究发现由于人体对膳食多酚的吸收和利用能力有限，使得多酚类物质及其代谢产物难以发挥作用，膳食多酚却能够通过影响肠道微生态系统从而发挥抵抗肥胖和缓解炎症的健康功效。葡萄籽原花青素提取物（GSPE）能够缓解高脂小鼠模型中小鼠的炎症和肥胖，但是这些效果在用抗生素处理小鼠后消失了，这个现象证明了GSPE是通过调节小鼠的肠道微生态系统来发挥抵抗肥胖的健康功效。已有研究报道，卡姆果在Germ-free小鼠模型中通过恢复小鼠的肠道微生态系统结构从而发挥抵抗肥胖和调节代谢紊乱的功效。已有研究报道，富含多酚的蔓越莓提取物能够通过增加Akkermansia菌属的丰度发挥抵抗肥胖的功效。肠道微生态系统的多样性和稳态由机体的年龄、基因、营养摄入和生活习惯等多种因素共同调控。本研究发现GE作为膳食干预剂能够对肠道微生态的稳定起到积极的作用。从许多研究中可以发现摄入GE后能够升高厚壁菌门与拟杆菌门的比例。从实验结果中发现，GE的干预能够增加小鼠中Bifidobacterium和Clostridium菌属的丰度，这些菌能够分泌胆盐水解酶，从而导致血清中的TαMCA 和TβMCA含量的下降。从结果中，可以发现Akkermansia菌与TαMCA 和TβMCA含量存在显著的负相关，但是目前还没有研究报道该菌具有分泌胆盐水解酶的能力，而类似的结果也在蔓越莓提取物抵抗高脂小鼠肥胖的研究中发现了。已有研究报道，富含多酚的膳食，例如可可、茶和红酒能够防止由于高脂饮食导致的肥胖，这些效果的产生与Akkermansia, Bifidobacterium和Lactobacillus这些菌具有相关性。有研究表明，每日服用红酒多酚能够显著增加人体中Enterococcus, Bacteroides, Bifidobacterium和Bacteroides菌的丰度。有研究表明，在体内和体外试验中，服用氯化锦葵色素和氯化锦葵色素苷类衍生物能够增加Bifidobacterium菌的丰度。
TGR5是细胞膜上的胆汁酸受体，在棕色脂肪组织中能够被次级胆汁酸激活。在棕色脂肪组织中，次级胆汁酸的含量增加，例如DCA, CDCA和LCA，能够导致TGR5的激活，并且导致下游基因D2转录水平的增加，D2基因通过调控PRDM16和UCP1基因转录水平升高从而调控棕色脂肪组织发生产热作用。本研究发现，GE的补充能够显著增加DCA的含量，而DCA能够通过调控TGR5-D2-UCP1途径刺激棕色脂肪组织发生产热作用。
葡萄和红酒中存在的原花青素和花色苷等多种膳食多酚都难以被人体和动物有效利用。本研究在血清中鉴定到多种更简单的酚类化合物，该结果说明肠道菌群能够降解膳食多酚。Jimenez-Giron等人发现在饮用葡萄汁后，可以从血浆中鉴定到CA，VA，syringic acid (SA), 3,5-dihydroxybenzoic acid (35DHBA), 3-O-methylgallic acid (3OMGA) 和ferulic acid (FA)。Jacobs等人报道人体在饮用红酒和葡萄多酚提取物后能够增加14种酚类代谢物。在本研究中也发现类似的结果，在摄入GE干预后，GA，PCA，HPA，CA和VA的含量增加了。但是，GA，PCA，HPA，CA和VA等酚类代谢物不能影响TGR5的转录水平，却能够上调UCP1的转录水平，这个结果说明可能存在另一条通路能够调控棕色脂肪组织。
但是本研究也存在一些不足之处。首先，只检测了小鼠的腹部白色脂肪、附睾白色脂肪和肝脏重量，还有很多其他的小鼠体成分没有检测。在该动物实验中，三组小鼠体重没有显著性差异，而在这种情况下检测小鼠的能量代谢更加具有说服力，由于可以排除小鼠体重差异带来的干扰。可以在Germ-free小鼠模型中验证GE的功效是否与肠道微生态系统具有依赖性，而基因敲除动物模型可以用来验证TGR5在棕色脂肪组织产热过程中的作用。
评论
通过饮食干预促进人体健康，缓解肥胖等代谢综合征成为新的趋势。本文使用富含膳食多酚的葡萄提取物作为膳食干预剂，从肠道微生态系统和胆汁酸代谢角度系统性研究了抵抗肥胖的机制，根据高脂小鼠的体征变化，分析能量代谢情况，确定起关键作用的菌属，并进一步关联分析胆汁酸与肠道微生态的相关性。随后，以胆汁酸受体TGR5为靶点，从代谢物、转录和蛋白水平等多角度验证对棕色脂肪组织激活的影响。本文为揭示膳食营养、肠道微生态系统与代谢综合征之间的关系提供了重要的依据。
原文网址：https://doi.org/10.1002/mnfr.202000149