CELL RES | 三所研究院校共同合作揭示小分子抑制剂通过空间阻断揭示USP14的变构调节
一、成果短讯：
2018年9月25日，北京理工大学、清华大学和中国农业科学院三所院校共同合作在国际期刊CELL RESEARCH发表了题为“ Small molecule inhibitors reveal allosteric regulation of USP14 via steric blockade “ 的研究成果，报道了小分子抑制剂通过空间阻断揭示USP14的变构调节。
二、内容简介：
泛素系统对于药物发现非常重要，并且选择性去泛素化酶（DUBs）的小分子抑制剂的发现仍然是一项活跃但极具挑战性的任务。除了少数例外，已经发现以及先前开发的抑制剂结合DUB的进化上保守的催化中心，导致差的选择性。小分子IU1是首次鉴定的特异性抑制剂，并且对USP14表现出令人惊讶的优异选择性，超过其他DUB。然而，这种选择性的分子机制尚不清楚。实验报道了与IU1和三种IU1衍生物结合的USP14催化结构域的高分辨率共晶结构。这些复合物的所有结构表明IU1及其类似物与USP14中先前未知的空间结合位点结合，从而阻断泛素C末端进入USP14的活性位点并消除USP14活性。重要的是，USP14中的这种空间位点是非常独特的，如USP14与几种已知的DUB X射线结构的结构比对所示。这些结果与生物化学表征相结合，表明IU系列化合物对USP14抑制的连贯空间阻断机制。根据最近FT671对USP7进行空间阻断的报道，这项工作提出了一种潜在的、普遍适用的、可通过空间阻滞调节DUBs的变构机制，正如我们发现的IU1-248强效10倍于IU1。
三、实验结果：
图1 USP14和IU1的表征。a 人类USP14 域结构。USP14包含两个结构域：N-末端泛素蛋白样结构域（UBL，1-80）和C-末端催化结构域（CAT，105-494） b IU1抑制蛋白酶体激活的USP14的Ub-AMC水解活性：15μMIU1显示出由1nM蛋白酶体激活的15nM USP14有明显的抑制。Ub-AMC泛素-7-氨基-4-甲基香豆素，Ptsm-VS蛋白酶体被泛素 - 乙烯基砜（Ub-VS）抑制。 c IU1的化学结构。d UB-PA测定表明，IU1通过抑制底物结合抑制USP14活性：3μM USP14 CAT在25℃下用DMSO或5mM IU1预孵育1小时，然后与12μM Ub-PA混合1小时。通过SDS-PAGE和 Coomassie蓝染观察所有结果。Ub-PA泛素 - 炔丙基酰胺
图2 人类USP14 CAT -IU1的总体结构和USP14 对IU1的识别。a USP14 CAT -IU1复合体的整体结构。b USP14 CAT -IU1复合体结构的表面表示。c USP14 CAT -IU1和USP14 CAT-Ubal（PDB ID：2AYO）的结构排列表明这些复合物具有相似的结构。d apo USP14 CAT，USP14 CAT -Ubal和USP14 CAT -IU1 中BL2的结构比对。e 2 | Fo | - | Fc | 电子密度图，轮廓为1.5σ，覆盖IU1的所有原子。催化中心Cys114显示为红色球体。f USP14CAT -IU1与USP14CAT-Ubal结构的排列表明IU1可以阻止泛素的C末端进入催化中心。g USP14中IU1的配体结合。h USP14对IU1的识别。i 由UB-PA测定中证实，H426和Y436参与IU1识别。j通过Ub-AMC水解测定依次验证参与IU1识别的关键残基：15μMIU1显着抑制USP14 WT活性，但未显示对USP14 H426E，Y436A和Y476A突变体抑制
表1 数据收集和统计
图3 USP14 CAT -IU1复合物与其他DUB蛋白的结构比对。a USP14 CAT -IU1用APO USP7结构对比。b USP7和USP14中的IU1结合位点。c USP7和USP14 CAT的IU1配体结合的比较。d 100μM IU1降低F409A的UB-AMC水解活性而未降低WT USP 7蛋白的水解活性。Ub-AMC水解的线性动力学显示在左侧，统计分析的结果显示在右侧。e，f USP14 CAT -IU1与UCH-L1或UCH-L3一致。g，h Ub-PA测定显示IU1不抑制Ub-PA与USP7，UCH-L1或UCH-L3：3μMDUB蛋白结合，与DMSO或5mM IU1在25°预温育1小时，然后与12μMUb-PA混合1小时。通过SDS-PAGE和Coomassie蓝染观察所有结果
图4 结构导向抑制剂设计。a IU1-248 的化学结构。b表示蛋白酶体结合的USP14和IsoT的IU1及其衍生物IU1-248和IU1-47 的IC 50值的表。与IU1-47类似，IU1-248表现出比IU1高10倍以上的效力和更好的选择性。c 2 | Fo | - | Fc | 电子密度图，轮廓为1.5σ，几乎覆盖了IU1-248的所有原子。d USP14 CAT- IU1，USP14 CAT -IU1-248和USP14 CAT -IU1-47的结构排列证明这些抑制剂共有相同的配体结合。e如Ub-PA测定所证明，H426和Y436参与IU1-248识别。H426E或Y436A突变在加入2.5 mM IU1-248后恢复了USP14的Ub-PA共价结合活性
四、原文学习：