下一代感染性病原体测序
下一代测序具有改善临床和公共卫生微生物学的潜力。除了比传统方法更快更准确地识别病原体之外，高通量技术和生物信息学还可以为疾病传播、毒性和抗菌素耐药性提供新的认识。2014年，美国国会在美国疾病控制和预防中心(CDC)建立了先进分子检测(AMD)项目，在该项目的支持下，美国公共卫生系统正在将病原体基因组测序纳入传染病监测。病原体基因组的种群水平数据反过来支持更精确和有效的临床诊断的发展。假以时日，实验室也许能够用一个能容纳多种病原体的单一工作流程来取代许多传统的微生物过程。
下一代病原体测序是如何工作的
下一代测序是一项多功能技术，广泛应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫、动物载体和人类宿主。在可用的方法中进行选择取决于排序目标，并涉及准确性、效率和成本方面的权衡。对于常规测序，大多数美国临床和公共卫生微生物实验室使用短读测序平台形式，可产生长达1000碱基对的序列片段。尽管微生物基因组通常比人类基因组更小、更复杂，但长读测序技术(如单分子实时测序)对于构建完整、高度精确的基因组以及对质粒、重复序列和其他复杂区域的分类非常有用。
另一种不同的方法，纳米孔测序，依赖于通过工程蛋白纳米孔对单个DNA或RNA分子进行穿线，并监测每个孔的电流。第一个这样的商用仪器提供了相对较长的序列读取和数据分析，而测序仍在进行中。通过不断改进硬件和试剂，降低了早期在吞吐量和准确性方面的限制。由于设备的便携性、快速的样品制备、灵活性和相对较低的成本，纳米孔测序正在成为临床和公共卫生环境中病原体测序的一种可行的一线策略。
将原始序列数据转换为可操作的信息是复杂且计算密集型的(图)。第一步通常是将较短的片段组装成一个完整的序列，或者根据已知的参考基因组进行映射，或者使用重叠读取重新组装序列。将组装好的基因组与参考菌株进行比较，可以方便地进行许多不同的推断，如病原体识别、高分辨率菌株分型以及重要表型特征(如毒性、抗菌素耐药性)的预测。良好曲线和最新的参考数据库是非常重要的，因为微生物病原体发展迅速，细菌可以在不同菌株和物种之间交换质粒(通常编码毒性和抗菌素耐药性特征)。组装的基因组可以与其他基因组进行比较，以寻找系统发育群集作为传播的证据。每一步装配、应变分型、表型和聚类都需要不同的生物信息学工具，这些工具必须协调到一致的工作流中。
图:将病原体基因组序列数据转化为可操作信息的工作流
PCR显示聚合酶链反应
另一种不同的方法，纳米孔测序，依赖于通过工程蛋白纳米孔对单个DNA或RNA分子进行穿线，并监测每个孔的电流。第一个这样的商用仪器提供了相对较长的序列读取和数据分析，而测序仍在进行中。通过不断改进硬件和试剂，降低了早期在吞吐量和准确性方面的限制。由于设备的便携性、快速的样品制备、灵活性和相对较低的成本，纳米孔测序正在成为临床和公共卫生环境中病原体测序的一种可行的一线策略。
将原始序列数据转换为可操作的信息是复杂且计算密集型的(图)。第一步通常是将较短的片段组装成一个完整的序列，或者根据已知的参考基因组进行映射，或者使用重叠读取重新组装序列。将组装好的基因组与参考菌株进行比较，可以方便地进行许多不同的推断，如病原体识别、高分辨率菌株分型以及重要表型特征(如毒性、抗菌素耐药性)的预测。良好曲线和最新的参考数据库是非常重要的，因为微生物病原体发展迅速，细菌可以在不同菌株和物种之间交换质粒(通常编码毒性和抗菌素耐药性特征)。组装的基因组可以与其他基因组进行比较，以寻找系统发育群集作为传播的证据。每一步装配、应变分型、表型和聚类都需要不同的生物信息学工具，这些工具必须协调到一致的工作流中。
重要的实践考虑
在公共卫生领域，下一代测序在速度和序列差异的解决方面为监测和暴发调查提供了关键的优势。例如，在美国疾病控制和预防中心及其公共卫生合作伙伴维护的食源性疾病监测系统PulseNet中，从较老的分子方法(脉冲场凝胶电泳)向下一代测序的过渡正在顺利进行。PulseNet现在能够更早地发现疾病暴发，更准确地区分相关病例群集，更快地将疾病与潜在的受污染食品源联系起来。
将病原体基因组学与流行病学相结合，加强了公共卫生工作，以防止结核病等传染病的传播。基因分型结核分离株可以证实从接触者调查推断的传播，或建议显然不相关的病例之间的联系，帮助卫生部门更好地集中他们的资源。下一代测序技术有可能比传统检测方法更快地获得关于可能的抗分枝杆菌药物敏感性的信息，从而实现更具体、更及时的治疗。
下一代测序数据适用于标准化和共享，这是全球卫生伙伴关系的重要优势，如世界卫生组织的流感监测系统。开放的“测序优先”方法可以及时的帮助生成候选流感疫苗和准确的数据，快速识别流行的变异体，同时监测共同传播的病毒群体的动态。
下一代测序技术也为现场调查提供了优势。例如，在2015年埃博拉疫情爆发期间，英国的一个研究小组将一个纳米孔测序实验室装进标准行李中运往几内亚。在8个月的时间里，他们现场测定了142个埃博拉病毒基因组的序列，通常在1个工作日内完成;数据被传输到云端进行分析，第二天返回结果。尽管存在重大的后勤挑战，包括电力和互联网服务不可靠，该小组在没有从该国出口样本的情况下为流行病应对提供了可操作的信息。
在AMD项目的支持下，美国公共卫生实验室正在迅速采用下一代测序技术对食源性疾病、结核病、丙肝、军团杆菌和其他病原体进行监测和调查。然而，从研究到常规公共卫生和临床应用的过渡将必须克服重大挑战。在实验室级别，这些包括基础设施、劳动力开发、效率和成本。在更广泛、更系统的层次上，需要大量的工作来开发标准协议、熟练程度测试程序、专业指南和规则要求。
价值
与传统方法相比，下一代测序技术提高了速度、准确性和细节，但也增加了成本。例如，CDC的一项分析估计，下一代测序每株细菌的成本约为150至250美元，相比之下，脉冲场凝胶电泳的成本为94美元。整合多种病原体的工作流程可提高实验室效率，并有助于抵消这一成本;然而，向下一代测序的过渡还需要在实验室设备、计算机资源和培训方面进行大量的前期投资。需要更多的信息来评估下一代测序技术在患者、程序和社会层面的微生物学价值。
证据
例如，在选择抗逆转录病毒治疗艾滋病毒感染时，仅对几种病原体序列数据的具体临床应用提供了循证指南。来自细菌、病毒、真菌和寄生虫基因组的信息序列是许多新的基于核酸的诊断测试的基础，包括完全绕过微生物实验室的“护理点”测试。随着综合征诊断（如腹泻）的多功能面板得到越来越广泛的应用，将需要系统的努力来评估其临床有效性和实用性，以及它们对基于实验室的公共卫生监测的影响。
总结
下一代测序技术正在将公共卫生领域的研究方向转向传染病，以及对个别患者的治疗。在建立质量标准、报告和解释下一代测序数据方面进行更好的协调，可以使这些工作具有协同作用。