基因敲除载体构建技术原理

CRISPR/Cas9简介

CRISPR/Cas9系统是近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA。此tracrRNA/crRNA二元复合体引导Cas9蛋白与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，产生一个平末端的双链DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）。通过基因工程手段将crRNA/tracrRNA进行融合改造成一条sgRNA（Single Guide RNA），也能有效引导Cas9蛋白在靶点处进行切割。

图1 CRISPR/Cas9切割DNA示意图

使用CRISPR/Cas9进行基因敲除的技术原理

在哺乳动物细胞内，大部分DSB会通过非同源的末端连（NonHomologous End-Joining，NHEJ）途径或者同源重组修复（Homology-Directed Repair，HDR）途径进行修复。通常情况下的NHEJ 修复途径占优势，且容易导致缺口处产生插入或缺失突变（Indels）。

当使用一条sgRNA在蛋白编码基因的外显子内产生DSB时，若NHEJ修复导致了缺口处产生了非3倍数的indels，则会造成蛋白翻译时的读码框移码（Framshift），不再产生完整的蛋白，即“移码敲除”。

当使用两条sgRNA同时作用造成两个DSB时，NHEJ修复不但可造成染色体DNA片段的缺失，同时也可能造成读码框移码。这种基因组的双重修饰更强有力地破坏了编码蛋白的表达，即“片段敲除”。

图2 使用CRISPR/Cas9进行基因敲除示意图

使用CRISPR/Cas9进行点突变/基因敲入的技术原理

在外源供体DNA存在的情况下，供体DNA有几率通过同源重组的方式与切口处附近的基因组DNA进行碱基片段交换，因此HDR修复途径能进行精确的基因修饰。供体DNA作为修复模板，包含一段目的序列，其两侧序列与切口附近的基因组序列一致作为同源臂。这种供体DNA可以是单链的DNA（ssDNA），也可以是双链的DNA（dsDNA）。对于小的序列修改（如点突变），可以选择合成ssDNA Oligo作为修复模板。当需要进行大片段的序列修改时（如敲入荧光蛋白标签），则需要将目的序列与数百碱基长度的同源臂克隆至供体质粒，使用供体质粒作为修复模板。

HDR通常只活跃在分裂细胞中，受细胞状态和基因位点影响，其效率较NHEJ更低。