科研│CELL：大规模单细胞转录组图谱揭示新冠肺炎的免疫特征（国人佳作）
编译：微科盟 逍遥君，编辑：微科盟景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
2019年新型冠状病毒（新冠肺炎）患者的免疫反应障碍是一个反复出现的影响症状和死亡率的问题，但对相关免疫细胞的详细了解还不完整。本研究应用单细胞RNA测序技术，对来自196名新冠肺炎患者和对照组的284份样本进行了测序，创建了一个拥有146万个细胞的全面免疫格局。庞大的数据集能够确定不同的外周免疫亚型变化与不同的临床特征相关，包括年龄、性别、严重程度和新冠肺炎的疾病分期。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）RNA存在于多种上皮细胞和免疫细胞中，并伴有病毒阳性细胞内转录水平的显著变化。S100A8/A9的全身性上调，主要是由外周血中的巨核细胞和单核细胞引起的，可能是重症患者常见的细胞因子风暴的原因之一。本研究数据为了解新冠肺炎的发病机制和制定有效的治疗策略提供了丰富的资源。
论文ID
原名：COVID-19 immune features revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas
译名：大规模单细胞转录组图谱揭示新冠肺炎的免疫特征
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2021年2月
通讯作者：张泽民&金荣华&陈捷凯&王晓群&瞿昆&张政&苏冰&王红阳&王福生&赵平森&李祥攀&程涛&刘新东&卞修武&魏来&贝锦新&黄志伟&蒋庆华&周鹏辉
通讯作者单位：北京大学生科院&首都医科大学附属北京佑安医院&广州再生医学与健康广东省实验室&广州再生医学与健康广东省实验室&中国科学技术大学生科院&深圳第三人民医院&上海交通大学医学院&第二军医大学国家肝癌科学中心&中国人民解放军总医院第五医学中心&汕头大学医学院附属粤北医院&武汉大学人民医院&中国医学科学院血液病医院&陆军医科大学附属西南医院&陆军医科大学附属西南医院&中山大学中山眼科中心&中山大学肿瘤防治中心&哈尔滨工业大学生科院&哈尔滨工业大学生科院&中山大学肿瘤防治中心
DOI号：10.1016/j.cell.2021.01.053
实验设计
结果
1 新冠肺炎患者scRNA-seq数据分析
为了表征COVID-19的免疫特性，中国成立了COVID-19单细胞联盟（SC4），该联盟由中国的39个研究所或医院的研究人员组成。SC4统计了171例COVID-19患者的scRNA-seq数据集，包括22例轻度或中度症状患者、54例重度症状住院患者和95例恢复期者（57例轻度或中度症状患者和38例重度症状患者）。本研究将具有轻度或中度症状的患者合并为一组；将有严重症状或处于危重阶段的患者合并为一组，此外还加入了25例根据WHO分类的健康对照者,从外周血（PBMC）和呼吸系统（BALF）共采集的284份样本进行了scRNA-seq测序（图1A）。分析发现共包含64个细胞群（图1B），其中，各种增殖的CD8+T细胞、CD4+T细胞和血浆B细胞在BALF中比PBMC中更丰富（图1C）。类似地，在疾病进展阶段，重症新冠肺炎患者中增殖和活化的B细胞、T细胞和巨噬细胞也显著更多（图1D）。
图1. COVID-19患者和健康对照者的多组织、多阶段单细胞图谱。（A）本研究整体实验设计的流程图。用虚线圈出的细胞在疾病进展阶段的样本中富集；（B）来源于COVID-19患者和健康对照者的单细胞转录组概述；（C）通过观察细胞数量与随机预期细胞数量的比值（RO/E）测量每个细胞簇的组织偏好；（D）通过RO/E测量的每个群集的患者组偏好。
2 患者年龄、性别、COVID-19严重程度和分期与PBMC组成的相关性
为了解析年龄、性别、疾病严重程度和分期与PBMC中免疫细胞组成变化的相关性，对159个PBMC样本应用方差分析。同时，为了让结果更加准确，还在方差模型中纳入了样本类型（新鲜或冷冻PBMC）和样本时间（症状发作后天数）。结果发现，虽然大多数B细胞簇与疾病恢复状态相关，但XBP1+浆细胞（B_c05MZB1-XBP1）与COVID-19严重程度相关（图2A）；无论样品类型如何（新鲜或冷冻），相比于其他个体（＜3%），重度COVID-19患者PBMC中浆细胞百分比高达15%（图2B）。与之前报道的重度COVID-19患者的血清具有高滴度的SARS-CoV-2特异性抗体一致，PBMC中的这些血浆B细胞高表达编码IgA1、IgA2、IgG1或IgG2恒定区的基因（图2C），暗示了其在抗原特异性抗体分泌中的功能；无论样本处理方法或采样时间如何，重度COVID-19患者在进展期和恢复期的DC_c4-LILRA4均降低（图2A、2D）。Neu_c3-CST7是PBMC中最大的中性粒细胞簇，与患者年龄、COVID-19严重程度和分期显著相关（图2A、2E）。
对于T细胞，以MKI67高表达为标志的不同增殖T细胞亚群与COVID-19严重程度和分期表现出明显的相关性（图2A）。COVID-19患者的T_CD4_c13-MKI67-CCL5low细胞群升高，尤其是在疾病进展阶段的重度疾病患者中（图2F）。鉴定出3个增殖的CD8+T细胞簇，包括T_CD8_c10-MKI67-GZMK、T_CD8_c11-MKI67-FOS和T_CD8_c12-MKI67-TYROBP，它们在COVID-19患者中增加，但与COVID-19严重程度表现出不同的相关性（图2A）。T_CD8_c10-MKI67-GZMK是一种增殖效应记忆CD8+T细胞群，表现为STMN1、HMGB2、MKI67和GZMK的高表达，在重度COVID-19患者中增加，特别是在恢复期（图2G）。增殖期CD8+T细胞簇在不同严重程度和阶段的变异可能表明SARS-CoV-2感染诱导的T细胞反应的复杂性。
T_CD8_c01-LEF1与患者年龄显著相关（图2A和2H）；此外，还观察到与性别相关的T细胞亚群，包括T_CD4_c04-ANXA2、T_CD4_c08-GZMK-FOShigh和T_CD8_c02-GPR183（2A和2I）。与PBMC中升高的增殖T细胞相比，COVID-19患者中大多数T细胞簇减少，并与疾病严重程度相关。显著减少的T细胞簇包括γδT细胞（T_c14_gdTTRDV2）和T_CD8_c09-SLC4A10。因此，基于流式细胞术的分析表明重度COVID-19患者外周血中γδT细胞和MAIT细胞减少。
图2.患者年龄、性别、COVID-19严重程度和分期与PBMC中细胞组成的相关性。（A）方差分析热图；（B）基于159份未分选PBMC样本的血浆B细胞组成比较（B_c05-MZB1-XBP1）；（C）B_c05-MZB1-XBP1的重链类别；（D–G）DC_c4-LILRA4、Neu_c3-CST7、T_CD4_c13-MKI67-CCL5Low和T_CD8_c10-MKI67-GZMK的组成比较；（H）年龄与T_CD8_c01-LEF1之间的相关性（Spearman相关性）；（I）T_CD4_c08-GZMK-FOShigh的性别差异。
3 患者年龄、性别、COVID-19严重程度和分期与B细胞和T细胞库多样性的相关性
本研究的scRNA-seq数据还包含TCR和BCR序列数据，从而为研究COVID-19患者的TCR/BCR使用提供了丰富的资源。方差分析显示PBMC中B细胞和T细胞亚群的多样性与各种临床特征具有异质性相关性（图3A）。一组不同的B细胞和T细胞亚群显示与COVID-19严重程度相关（图3A）。如T_CD4_c02-AQP3（图3B）、T_CD4_c08-GZMK-FOShigh（图3C）、T_CD8_c01-LEF1（图3D）和T_CD8_c02-GPR183（图3E）所示，重度COVID-19患者中这些T细胞亚群的TCR多样性往往小于中度疾病患者，尤其是在疾病进展阶段。在这些簇中，某些T细胞亚群也显示性别和年龄相关变异（图3A），如T_CD4_c08-GZMK-FOShigh（图3F）、T_CD8_c01-LEF1（图3G）、T_CD8_c05-ZNF683（图3H）和T_CD8_c09-SLC4A10（图3I）。一般而言，这些T细胞亚群的多样性在女性中高于男性，在年轻个体中高于老年个体。虽然某些B和T细胞亚群的多样性受到技术变化的影响，包括样本处理方法和采样时间，但方差分析仍能从这些技术考虑中剖析临床特征的影响，并确定了对技术干扰稳健的相关性（图3A）。
尽管未发现相同的BCR，但与健康对照相比，COVID-19患者的BCR库表现出VDJ偏倚。通过训练一个具有VDJ使用频率的随机森林分类器来区分中度或重度症状的COVID-19患者和健康对照者，发现通过曲线下面积值测量的分类准确性高达0.85。在通过随机森林选择的区分重度COVID-19患者和健康对照的前20种重要VDJ组合中，14种具有与实验验证的中和抗体相同的VDJ使用（图3J）。目前已知的SARS-CoV-2中和抗体的VDJ使用偏向于IGHV3和IGHV1（图3J）。特别是使用IGHV3-53的中和抗体超过40种。这些观察结果和数据可能对鉴定新的中和抗体很重要。
图3.患者年龄、性别、COVID-19严重程度和分期与PBMC中B和T细胞库多样性的相关性。（A）方差分析热图；（B–E）T_CD4_c02-AQP3，T_CD4_c08-GZMK-FOShigh，T_CD8_c01-LEF1和T_CD8_c02-GPR183的比较；（F）T_CD4_c08-GZMK-FOShigh的性别差异；（G–I）T_CD8_c01-LEF1、T_CD8_c05-ZNF683和T_CD8_c09-SLC4A10的TCR多样性与年龄的相关性；（J）已发表的SARS-CoV-2中和抗体的V基因使用及其与本研究数据集中差异使用的IGHV基因的关系。
4 在多种上皮和免疫细胞类型中检测到SARS-CoV-2的RNA
从处于疾病进展期的COVID-19重度患者的6份BALF和2份痰液样本中，检测了来自纤毛、分泌和鳞状上皮细胞的3085个细胞和一组不同的免疫细胞中SARS-CoV-2的病毒RNA，包括中性粒细胞、巨噬细胞、血浆B细胞、T细胞和NK细胞（图4A）。中度COVID-19患者BALF中获得的细胞较少，未检测到SARS-CoV-2 RNA。通过相应的标记基因证实了这些SARS-CoV-2 RNA阳性细胞的同一性（图4B）。有趣的是，免疫细胞比上皮细胞拥有更多的病毒RNA序列（图4C）。由于ACE2和TMPRSS2在介导SARS-CoV-2进入中发挥关键作用，检测了其在这些细胞中的表达水平（图4D）。发现ACE2和TMPRSS2在这些上皮细胞的一个亚群中表达。而免疫细胞不表达ACE2或TMPRSS2。然后，在数据中检查了最近报告与SARS-CoV-2进入相关的宿主因素，发现BSG和TFRC与不同细胞类型中病毒RNA的丰度相关（图4E）。
由于干扰素刺激基因（ISG）通常与病毒RNA感知相关，接下来检测了这些细胞中ISG的表达（图4F）。与PBMC中SARS-CoV-2 RNA阴性的匹配细胞类型相比，ISG基因在这些病毒RNA阳性免疫细胞中表达升高。与BALF中相同类型的病毒RNA阴性免疫细胞相比，SARS-CoV-2 RNA阳性上皮细胞，包括纤毛、分泌和鳞状细胞，以及病毒RNA阳性中性粒细胞的ISG表达水平明显更高。然后，检测了这些细胞中不同SARS-CoV-2基因的检出率（图4G）。SARS-CoV-2基因组的正链和负链（至少亚基因组）可能都存在于这些细胞类型中，暗示了病毒复制和转录是活跃的（图4G）。用免疫组织化学（IHC）染色COVID-19重度患者肺组织中的病毒刺突蛋白，进一步验证了淋巴细胞中病毒信号的存在（图4H）。
图4. 从BALF（6/12）和痰液（2/22）样本中检测到SARS-Cov-2 RNA的细胞类型。（A）3085个细胞，检测到SARS-Cov-2 RNA；（B）用于确定细胞类型的标记物；（C）通过log（CPM）定量每个细胞中的病毒载量；（D）文献中报道的与SARS-CoV-2感染相关的宿主因子的表达水平；（E）宿主因子表达与病毒载量的Pearson相关性；（F）检测到病毒RNA的细胞中ISG的表达水平；（G）10X enomics 50和30平台上不同细胞类型中SARS-CoV-2基因的检出率；（H）肺组织中CD3和SARS-CoV-2刺突蛋白的IHC染色。
5 SARS-CoV-2 RNA阴性上皮细胞之间的转录组差异以及对细胞间相互作用的潜在影响
SARS-CoV-2 RNA在不同上皮细胞中的存在似乎与额外的转录变化有关。对于鳞状上皮细胞，SARS-CoV-2 RNA阳性细胞表现出多种基因的高表达，如NT5E、CLCA4和SULT2B1（图5A）。这些基因在诸如“对病毒的反应”、“对I型干扰素的反应”和“对缺氧的反应”等通路中都被富集（图5B）。相反，SARS-CoV-2 RNA阳性和阴性纤毛上皮细胞之间的差异基因数量要少得多，而且几乎没有基因在所有三种上皮细胞类型中显示出一致的变化（图5C）。接下来，探讨了上述转录改变的潜在影响。发现SARS-CoV-2 RNA阳性纤毛上皮细胞、分泌性上皮细胞和鳞状上皮细胞在重度组和中度组之间显示出明显的相互作用潜力（图5D）。
SARS-CoV-2 RNA阳性的纤毛上皮细胞显示出较低的相互作用电位，并分散在与呼吸道拓扑等效的外部隔室（图5E），类似于呼吸道冠状病毒感染的上皮剥脱的病理现象。这些变化在新冠肺炎患者中是一致的（图5E）。纤毛上皮细胞、分泌细胞和鳞状上皮细胞之间的比较也突出了纤毛细胞的分散趋势和鳞状细胞之间的相互作用潜力（图5F和5G）。在重症患者中，病毒RNA阳性的鳞状细胞通过ANXA1-FPR1和S100A9/A8-TLR4轴与中性粒细胞和巨噬细胞显著相互作用（图5H）。中性粒细胞和巨噬细胞与病毒RNA阳性的鳞状上皮细胞表现出高的相互作用潜力，也容易出现SARS-CoV-2RNA阳性（图5I）。由于ANXA1-FPR1和S100A9/A8-TLR4的相互作用已被报道在脓毒症和肿瘤的免疫细胞招募和炎症级联反应中发挥关键作用，推测它们也可能在新冠肺炎的发病机制中发挥重要作用。
图5. 病毒RNA的存在对上皮亚型的表达和细胞间相互作用的影响。（A）鳞状细胞之间存在差异表达的基因；（B）如（A）所示，在病毒呈阳性的鳞状细胞中高表达基因的GO分析；（C）不同上皮细胞中上调的基因与病毒检测的Venn图；（D）细胞-细胞相互作用网络；（E）各细胞之间的自身距离；（F）用病毒检测显示三种上皮细胞自身距离；（G）所有BALF样本中检测到病毒的三种上皮细胞的中位数自我距离；（H）饼图显示配体受体对病毒阳性的鳞状细胞和病毒阳性的中性粒细胞（上）和病毒阳性的鳞状细胞和病毒阳性的巨噬细胞之间的相互作用（下）；（I）鳞状细胞（有无病毒检测）与巨噬细胞（左）和中性粒细胞（左）之间的相互作用和病毒检测。
6 巨核细胞和单核细胞亚群是触发细胞因子风暴的关键来源
研究发现患者细胞因子和炎症基因的表达明显升高，尤其是在严重进展期（图6A），提示可能存在炎症细胞因子风暴。检测到7种细胞亚型，包括3种单核细胞亚型、3种T细胞亚型，以及1种巨核细胞亚型。
然后调查了这七种细胞亚型在患者中的比例，发现这些高炎性细胞亚型在严重疾病患者中有所丰富。这些炎性细胞亚型在PBMC中的比例在患者组中表现出不同的富集模式（图6B）。Mono_C1-CD14-CCL3在可能伴有炎症风暴的重症患者亚群中高度富集（图6C），这些细胞的比例也与相应患者的年龄相关（图6D）。在另一批严重疾病患者中，高炎性巨核细胞被富集，这些患者也可能经历了过度的炎症反应（图6B和6C）。
相反，Mono_c2-CD14-HLA-DPB1和Mono_c3CD14-VCAN亚型广泛分布于各个疾病阶段，重症患者进展期高炎性T细胞（如T_CD4_C08-GZMK-FOShigh亚型）的比例下降（图6B、6C），但这两种单核细胞亚型在老年恢复期患者中比例均升高（图6D）。综上所述，Mono_C1-CD14-CCL3和巨核细胞可能是触发细胞因子炎症风暴的PBMC的主要来源，某些T细胞亚型也可能通过增强促炎细胞因子的表达而导致炎症风暴。
在每一种细胞亚型中都有独特的促炎细胞因子基因表达（图6E），如TNF、CCL3、IL1B、CXCL8、IL6、TGFB1、LTB和IFNG。在重症患者，特别是危重患者的血浆中检测到更高水平的CCL3、IL1RN和TNF（图6E）。重症患者有更高水平的多种促炎细胞因子，如IL1B、TNF、IL-6和CCL3（图6F）。虽然炎性巨核细胞高表达细胞类型识别标记基因，如PPBP，但与健康对照组相比，这些基因的表达水平降低，表明这些细胞在炎症激活后功能丧失（图6E和6G）。此外，促炎细胞因子CXCL8和IFNG在疾病进展的患者中表现出年龄依赖性的表达，而在健康对照组中没有观察到显著意义（图6H）。无论是患者还是健康对照组，PPBP与年龄均无相关性，表明巨核细胞功能的潜在丧失可能与年龄无关（图6H）。
图6. 外周血中的Mono_C1-CD14-CCL3和巨核细胞似乎触发炎性细胞因子风暴。（A）t-SNE图；（B）7种高炎性细胞亚型的热图；（C）Mono_C1-CD14-CCL3、MegA和T_CD4_C08-GZMK-FOSS高富集区细胞比例差异。（D）Mono_c1-CD14-HLA-DPB1，Mono_c3-CD14-HLA-DPB1，Mono_c1-CD14-CCL3，Mono_c2-CD14-HLA-DPB1和Mono_c3-CD14-VCAN簇的年龄/细胞比例的普通最小二乘模型。（E）细胞因子表达热图。（F）基于scRNA-seq和血浆图谱的细胞因子表达框图。（G）Mono_C1-CD14-CCL3、MegA和T_CD8_C06-TNF簇细胞因子表达的盒图。（H）Mono_C1-CD14-CCL3、MegA和T_CD8_C06-TNF簇细胞因子表达与年龄的普通最小二乘模型。
7 肺和外周血中高炎性细胞亚型的相互作用
细胞因子风暴可能对肺造成免疫病理损伤，因此比较了BALF中捕获的所有细胞亚型的炎症和细胞因子评分。在上皮细胞中没有观察到细胞因子基因的富集，而巨噬细胞和单核细胞亚型在进展（严重）样本中有最高的细胞因子和炎症评分（图7A）。类似于对PBMC的分析，确定了五种高炎性细胞亚型，包括Macro_c2-CCL3L1，三种单核细胞亚型，以及中性粒细胞（图7B），这表明这些细胞亚型可能是导致肺组织炎症风暴的主要来源。与PBMC不同，BALF标本中无一例CD4+或CD8+T细胞的炎症评分或细胞因子评分升高。每个高炎症亚型都高度表达特定的细胞因子（图7C）。
以此推测全身性炎症风暴也可能与肺和外周血之间通过分泌不同的细胞因子而产生的细胞串扰有关。为了验证这一点，分析了PBMC和BALF中重度和中度炎性细胞亚型之间的配体-受体配对模式。PBMC和BALF细胞之间的相互作用似乎显示出明显的变化（图7D）。数据显示，与中度相比，重度患者高炎症细胞的配体-受体相互作用增强。BALF中的Mono_C1-CD14-CCL3细胞表达CCR5，可在肺组织和外周血中接受其他细胞分泌的多种细胞因子刺激。而Macro_c2CCL3L1细胞之间的相互作用主要依赖于CCR2和IL1R2。总而言之，这些发现阐明了新冠肺炎患者炎症状态下肺界面潜在的细胞间相互作用的分子基础。
图7. 肺和外周血中高炎症细胞亚型的相互作用。（A）BALF细胞的t-SNE图；（B）细胞亚型炎症评分；（C）5种高炎性细胞亚型的热图和细胞因子表达的无监督聚集。（D）Circos图。
讨论
SC4联盟成员生成了来自中国196名新冠肺炎患者和健康对照的284份临床样本的scRNA-seq数据，并构建了一个信息丰富的数据资源，用于以单细胞分辨率解剖新冠肺炎患者的免疫应答。这一数据集涵盖了新冠肺炎患者的肺和血液样本，这些患者年龄范围广，性别比例平衡，症状中度和重度，以及进展期和恢复期。64个注释良好的细胞亚群被聚集在一起，提供了对SARS-CoV-2感染的细胞和分子反应的详细信息。
数据集的综合性被证明在剖析年龄、性别、疾病严重程度和分期与SARS-CoV-2感染的不同免疫亚群之间的关系方面是强大的。一般来说，血浆B细胞和增殖性T细胞与疾病严重程度有关，而这些适应性免疫细胞类型的前体细胞的组成差异更容易受到性别和年龄的影响。值得注意的是，年龄和性别似乎也影响了大范围T和B细胞的TCR/BCR谱系的多样性，这可能具有临床意义。
研究证明了SARS-CoV-2序列在上皮细胞和免疫细胞中的存在，以及任何转录特性的改变。人类呼吸道多种上皮细胞（包括纤毛状细胞、分泌型细胞和鳞状细胞）中存在病毒序列很可能是由病毒感染所解释的，尽管病毒存在的后果似乎是不同的。SARS-CoV-2 RNA存在于包括中性粒细胞、巨噬细胞、血浆B细胞、T细胞和NK细胞在内的各种免疫细胞中。虽然目前还不清楚这些免疫细胞如何获得病毒序列，但发现为进一步探索这些重要问题提供了容易处理的角度。
在试图剖析潜在细胞因子风暴的细胞起源时，发现巨核细胞和一些单核细胞亚群可能是严重疾病进展的新冠肺炎患者多种细胞因子高度升高的关键来源。
总而言之，本研究涵盖不同疾病严重程度和阶段的大型scRNA-seq数据集,揭示了新冠肺炎的多种免疫特性，这些特性以前没有得到充分的认识。这些数据为剖析新冠肺炎的发病机制提供了关键的资源和重要的见解，并可能有助于开发有效的治疗方法和疫苗来对抗SARS-CoV-2。
1 科研│SCI IMMUNOL：COVID-19和流感的免疫表型凸显I型干扰素在重症COVID-19发展中的作用
不来关注一波嘛
END