科研 | PLANT CELL：导入蛋白及其两种拮抗物质对根分生组织中PLETHORA1的转录调控（国人佳作）
编译：依然，编辑：景行、江舜尧。
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植物的根是通过根尖的分生组织活动来维持的。根分生组织发育过程中有两条转录途径，一条由OLETHORAs（PLTS）介导，另一条由SHORTROOT(SHR)和SCARECROW(SCR)介导。PLTs在根分生组织发育过程中需要一个浓度梯度，这不仅是由生长稀释和细胞间运动等翻译后调控所致，还可能是由一种鲜为人知的微调转录调控机制造成的。作者报道了拟南芥通过招募RNA聚合酶II(Pol II)到PLT1并与PLT1相互作用来正向调节PLT1在根分生组织中的表达。GIF1/AN3是一种负调控PLT1表达的转录辅助因子，通过GRF相互作用因子FCTOR1/ANGUSTIFOLIA3(GIF1/AN3)与JANUS的竞争性结合，抑制了Pol II的JANUS依赖的招募。最后，PLT1的拮抗调节因子GIF1和JANUS都依赖于拟南芥IMPORTINβ4(IMB4)的核积累。在PLT1转录中，importin与其两个拮抗成分的结合可能在微调根分生组织中PLT1的转录方面有益处。
论文ID
原名：Transcriptional Regulation of PLETHORA1 in the Root Meristem Through an Importin and its Two Antagonistic Cargos
译名：导入蛋白及其两种拮抗物质对根分生组织中PLETHORA1的转录调控
期刊：Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020年9月
通讯作者：黎莎
通讯作者单位：山东农业大学
DOI号：10.1105/tpc.20.00108
实验设计
结果
作者基于转基因植物中IMB4g-GFP结构的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)确定，即使IMB4在根中高度表达(图1A)，但与野生型相比，imb4-1中的根尖分生组织(RAM)细胞表现出显著的核GIF1积累减少。因此，作者预估imb4-1突变体的RAM更长，然而，imb4-1表现出明显的根分生组织减少(图1B，1D)，这是由于细胞分裂活性降低(图1C，1E)。对根分生组织发育至关重要的基因PLT1、PLT2和Scr均在imb4-1突变体中转录下调(相对于野生型)，基于对它们各自的报告系的分析，其中青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)的表达是由其天然启动子驱动的(图1F-K)，实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)独立地验证了这些结果(图1L-N)，从而表明IMB4在根分生组织发育中起着积极的作用。
图1.IMB4的功能丧失影响了根分生组织的活性。(A)IMB4g-GFP幼苗根的典型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。根部用PI(洋红)染色。(B)PI染色的野生型和imb4-1根的代表性CLSM图像。(C)CycB1；1PRO：野生型和imb4-1根中GUS活性。根尖分生组织(RAM)的区域由(A-C)中的两个箭头表示。(D-E)根分生组织带(MZ)的长度(D)或细胞数(E)。数值为平均值±标准差(n>16)。字母不同表示两组间差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。(F-K)野生型和imb4-1根中SCRpro：H2B-YFP(F，I)、PLT1pro：CFP(G，J)或PLT2pro：CFP(H，K)的代表性CSLM图像(F-H)或荧光强度(I-K)。A.U.A.。表示任意单位。用PI(洋红)对根部进行染色。数值为平均值±SD(n>16)(J，K)或平均值±标准差(n=10)(I)。测量了10根细胞核的荧光(I)，测量了16根以上的干细胞生态位的荧光(J，K)。用RT-qPCR方法测定野生型和imb4-1幼苗萌发后5d(DAG)Scr(L)、PLT1(M)或PLT2(N)的相对转录丰度(L-N)。(I-N)中的星号表示差异显著(t检验，P<0.05)。
2 IMB4介导JANUS的核积累
通过筛选拟南芥蛋白质互作组数据库(AtPID)，作者将重点放在了几个潜在的IMB4相互作用因子中的JANUS上。JANUS是一个假定剪接体成分，作者通过酵母双杂交(Y2H)(图2A)、双分子荧光互补(BIFC)(图2B)和体外下调试验(图2C) 确认JANUS与IMB4相互作用。为了确定IMB4是如何调控JANUS的，作者又利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)分析了绿色荧光蛋白(GFP)在野生型和表达JANUSg-GFP突变体的根分生组织中的分布。作者发现有很强的GFP信号在野生型细胞的细胞核中表达，但imb4-1不表达(图2D-E)，尽管JANUSg-GFP在野生型和imb4-1中的表达水平相当(补充图2B)，表明JANUS的核积累依赖于IMB4。事实上，用蛋白酶体抑制剂MG132抑制26S蛋白酶体介导的降解大大增加了野生型和imb4-1中JANUS-GFP融合蛋白的核强度(图2D-E)，表明IMB4保护了JANUS免受26S蛋白酶体介导的降解。此外，在MG132处理后，野生型和imb4-1的细胞质中都出现了GFP信号(图2D-E)，这表明JANUS在细胞质中经历了快速的周转。通过细胞分级和免疫印迹分析，作者证实IMB4通过阻止26S蛋白酶体介导的降解来积极调节JANUS的核积累(图2F)。这些结果表明，JANUS在胚胎发育早期的核积累受IMB4以外的其他因素的调控。
图2.IMB4参与了JANUS的核积累。(A-B)酵母双杂交(Y2H)(A)或双分子荧光互补(BIFC)(B)分析显示JANUS和IMB4之间的特异性相互作用。另一种拟南芥导入蛋白βKPNB1作为IMB4的阴性对照，而剪接体的另一组分AtBud13作为JANUS的阴性对照。在不含Trp和Leu(-WL)的合成最小培养基上筛选同时携带BD和AD载体的酵母菌落；在不含Trp、Leu、His和Ade(-WLHA)的合成最小培养基上检测正相互作用。(C)体外下调试验。这些结果代表了三种生物复制的结果。(D-E)DMSO或MG132处理后野生型(WT)的JANUSg-GFP或IMB4-1(IMB4-1)的JANUSg-GFP的代表性CLSM图像(D)或GFP强度(E)。A.U.A.。表示任意单位。用PI(洋红)对根部进行染色。用二甲基亚砜和100μMG132处理幼苗根5DAG 2 h，取值为均值±扫描电镜(n=20)，测量根MZ细胞核的荧光强度。不同字母表示差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。(F)细胞分级和免疫印迹分析。T，总；C，细胞质；N，细胞核。用抗GFP抗体免疫印迹法检测JANUS-GFP。底部的数字是细胞核部分(N)或胞浆部分(C)中JANUS-GFP相对于总蛋白部分(T)的值，设置为1。抗组蛋白H3和抗cFBPase分别表示细胞核和胞浆部分。
3 JANUS正向调节根分生组织活性
为了研究JANUS在根分生组织发育中的潜在作用，作者通过RNAi干扰(RNAi)研究了表达35Spro：JANUS-RNAi的转基因根如何下调JANUS转录本，发现下调JANUS确实可以导致根分生组织发育严重减少(图3A)。由于细胞分裂减少(图3B，3D)，35Spro：JANUS-RNAi植株的根分生组织明显变短(图3C)。通过分析JANUS-RNAi系中SCRpro：H2B-YFP(图3E)、PLT1pro：CFP(图3F)或PLT2pro：CFP(图3G)的荧光强度，作者确定了JANUS-RNAi显著下调了PLT1(图3I)和PLT2(图3J)的转录活性，但没有下调SCR(图3H)。
由于所有这三个基因都在胚胎发生过程中表达，而且JANUS对胚胎发生是必不可少的，作者检查了表达报告SCRPro：H2B-YFP(补充图4A)、PLT1Pro：CFP(补充图4B)或PLT2Pro：CFP(补充图4C)的JANUS胚胎。作者发现PLT1和PLT2的转录活性在JANUS胚胎中显著下调，但SCR没有下调(补充图4)，这些结果表明，JANUS正向调控根分生组织的发育，可能是通过转录调控PLT来实现的。
4 JANUS调控依赖于Pol II的PLT1转录。
为了验证JANUS在根分生组织中的功能是否通过Pol II，作者首先研究了依赖RNA的RNA聚合酶II、IV和V NRPB10的非催化亚基是否参与了根分生组织的发育。其次，确定nrpb10突变体中PLT1的转录活性显著降低(补充图5D，5G-H)。这些结果表明，Pol II通过调节关键调控基因的转录，对根分生组织的发育起正向调控作用。
为了验证Pol II在PLT1转录中的作用也可能取决于JANUS的假设，作者用染色质免疫沉淀(CHIP)法检测了PLT1启动子上的Pol II占位情况(图4A)。在JANUS-RNAi系或imb4-1突变体(图4B)中，JANUS下调PLT1启动子区域的Pol II占有率显著降低，表明JANUS通过招募Pol II到PLT1启动子来介导根分生组织发育过程中PLT1的转录。作者在JANUS-RNAi背景中引入了UBQ10pro：GFP-PLT1。正如预期的那样，PLT1的异位表达部分弥补了JANUS-RNAi系的RAM长度缩短(图4C，4E-F)，这与RT-qPCR显示PLT1丰度的显著增加一致(图4D)。这些结果表明，PLT1转录水平的降低是JANUS-RNAi中RAM减小的主要原因。
图4.JANUS介导Pol II依赖的PLT1转录。(A)PLT1基因位点示意图。字母(a，b)表示ChIP-PCR中的靶区。(B)芯片聚合酶链式反应(ChIP-PCR)定量。PLT1时的POL II浓度以PLT1(POL II/INPUT)与肌动蛋白(POL II/INPUT)的比率表示。结果为均值±扫描电镜(n=3)。星号表示与野生型有显著差异(t检验，P<0.05)。(C)来自野生型的具有代表性的PI染色根，35Spro：JANUS-RNAi-1，或两个35Spro：JANUS-RNAi UBQ10pro：GFP-PLT1系(res-1，res-2)。RAM的区域由两个箭头表示。(D)野生型PLT1的相对转录丰度，35Spro：JANUS-RNAi-1(RNAi-1)或35Spro：JANUS-RNAi-1UBQ10pro：GFP-PLT1(res-1，res-2)的两条线。取值为均值±扫描电镜(n=3)。从5株DAG幼苗中提取RNA。(E-F)根分生组织的长度(E)或细胞数(F)。数值为均值±标准差(n>17)。(D-F)不同字母表示两组间差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。
作者假设在JANUS-RNAi系中PLT1丰度的显著降低将导致WOX5表达的降低。为了验证这一假设，作者将WOX5pro：GFP报告基因引入JANUS-RNAi系以及imb4-1和nrpb10突变体中，这两个突变体都在PLT1的表达上受到了影响。通过检测野生型(图5A)中WOX5pro：GFP的QC处的GFP强度，JANUS-RNAi中的两个WOX5pro：GFP系(图5B-C)，imb4-1中的WOX5pro：GFP(图5D)，以及nrpb10中的WOX5pro：GFP(图5E)，作者确定在JANUS-RNAi，imb4中WOX5pro：GFP的转录活性显著降低。在JANUS-RNAi、imb4-1和nrpb10背景下，WOX5转录丰度降低(图5G)。这些结果进一步支持PLT1的JANUS依赖性转录。
图5.WOX5的表达取决于IMB4、JANUS和Pol II。(A-E)来自PI染色的5DAG幼苗根的静止中心(QC)的代表性CLSM图像，在Col-0(WT)、两个35Spro：JANUS-RNAi系(RNAi-1和RNAi-2)、imb4-1或nrpb10中表达WOX5pro：GFP报告程序。箭头指向QC单元格。左侧是RFP(PI、洋红色)和GFP通道的合并；右侧是以伪彩色显示的GFP通道(右下角的亮度比例)。(F-G)GFP强度(F)或WOX5丰度(G)来自Col-0(WT)中的WOX5pro：GFP报告基因、两个35Spro：JANUS-RNAi系(RNAi-1和RNAi-2)、imb4-1或nrpb10在QC细胞中的GFP强度(F)或WOX5丰度(G)。A.U.A.。表示任意单位。均值±SD(n>30)(F)；均值±SEM(n=3)(G)。从5株DAG幼苗中提取RNA。字母不同表示差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。
5 通过与PLT1的相互作用实现PLT1的自动转录调控需要JANUS
由于JANUS不包含可辨别的DNA结合域，作者想确认JANUS如何影响根分生组织中的PLT1转录，以及胚胎发生过程中的WOX2和PIN7转录。作者使用JANUS作为诱饵进行了Y2H筛选。作者在潜在的JANUS相互作用因子中确定了PLT1，并通过有针对性的Y2H(图6C)和BIFC检测(图6B)证实了这一结果。经过仔细研究，作者确定PLT1与JANUS的C末端相互作用(图6C)，而Pol II组件与JANUS的N-末端结构域相互作用。
图6.JANUS与PLT1交互。(A)JANUS域组织示意图。RRM表示RNA识别基序；nJANUS表示JANUS的N-末端结构域，包括两个RRMS；cJANUS表示JANUS的C-末端结构域。(B)具有代表性的BIFC分析表明JANUS与PLT1在细胞核内相互作用。从左到右：YFP通道，35Spro：RFP(洋红色)表示的RFP通道，以及YFP、RFP和传输通道的合并。插图是顶部面板上的点划线方块的特写。(C)具有代表性的Y2H分析表明JANUS的C末端与PLT1相互作用。用BD和AD载体转化的Y菌落在人工合成的最低限度培养基WL上生长。正交互作用由人工合成的最小培养基-WLHA上的生长决定。这些结果代表了三种生物复制的结果。
通过检测干细胞利基的CFP强度作为内源性PLT1转录活性的替代指标，作者确定PLT1-OE增强，而PLT功能丧失降低PLT1转录活性(补充图6A-F)。作者通过RT-qPCR验证了这些结果(补充图6G)。事实上，PLT1基于酵母单杂交(Y1H)(图7A-B，7D)、CHIP(图7C)和体外转录分析(图7E-F)与其自己的启动子序列结合。因此，作者得出结论，PLT1正向调节其自身的转录。
由于JANUS通过不重叠的结构域与PLT1和Pol II相互作用，作者推测JANUS可能通过招募Pol II而对PLT1的自动转录调控起关键作用。作者检测了野生型PLT1pro：CFP报告基因以及PLT1-OE、JANUS-RNAi和PLT-OE JANUS-RNAi植物的CFP荧光。事实上，根据CFP强度(图7H-I)和RT-qPCR(图7G)，异位PLT1对内源性PLT1的增强转录显著低于JANUS的下调。值得注意的是，PLT1的过表达确实激活了JANUS-RNAi植物中内源PLT1的表达，尽管程度低于野生型(图7H-I)。无论如何，作者还观察到在胚胎根极形成过程中依赖JANUS的PLT1的自动激活(补充图7)，支持JANUS与PLT1相互作用参与PLT1的自动转录调控的观点。
图7.RAM中PLT1的自动转录调节需要JANUS。(A)PLT1启动子和5'非翻译区(UTR)示意图。P1-A跨度为-3652BP至-2809BP；P1-B跨度为-2809BP至-1854BP；b区跨度为-2047bpp至-1919BP；c区跨度为726BP至1103BP。(B)具有代表性的Y1H化验。空载体作为阴性对照，显示了P1和P1-B区的背景激活。(C)芯片聚合酶链式反应(ChIP-PCR)定量。PLT1的倍增是PLT1(芯片/输入)与肌动蛋白(芯片/输入)的比率。结果为均值±扫描电镜(n=3)。用5株DAG幼苗进行了测定。星号与野生型差异显著(t检验，P<0.05)。(D)Y1H法测定β-半乳糖苷酶活性。控件指示空向量。平均值为±SD(n=7)。字母不同表示差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。(E-F)与P1pro：NLS-GFP和35Spro：RFP-PLT1(洋红)或U1pro-70K-RFP(无核蛋白对照)共转化的叶表皮细胞的代表性CLSM图像(E)或GFP强度(F)。A.U.A.。表示任意单位。结果为均数±标准差(n>30)。P值位于条形图的顶部(t检验)。(G-I)野生型Col-0(WT)、两个UBQ10pro：GFP-PLT1系(OE1，OE2)、35Spro：JANUS-RNAi(RNAi-1)和35Spro：JANUS-RNAi UBQ10pro：GFP-PLT1(OE1；RNAi)的PLT1pro：CFP报告基因的内源性PLT1丰度(G)、CLSM图像(H)或CFP强度(I)。所有遗传背景均使用相同的PLT1pro：CFP转基因。顶部面板的图像是CFP和RFP通道(PI、洋红)的合并；底部是伪彩色的CFP通道，其强度覆盖每个数据集中的所有测量值(从最大到最小)。(G)值为均值±扫描电镜(n=3)。从5株DAG幼苗中提取RNA。(I)中的值为均值±SD(n>20)。测量干细胞壁的荧光强度。字母不同表示不同组别(Tukey's多重比较检验，P<0.05)。
6 GIF1竞争性地与JANUS与Pol II结合，调节PLT1转录
虽然GIF1和JANUS都受到IMB4的核积累调控，但它们在根分生组织发育过程中起着拮抗作用。事实上，GIF1作为另一位JANUS的互动出现在AtPID中。首先，作者通过Y2H(图8A)和BIFC分析(补充图8)验证了GIF1和JANUS之间的相互作用。值得注意的是，GIF1与JANUS的N-末端RNA识别基序2(RRM2)相互作用(图8A)，该结构域负责其与Pol II的相互作用(熊等人，2019年)。因此，作者认为GIF1可能与JANUS的RRM2结构域相互作用，竞争性地阻止JANUS-Pol II的相互作用，这可以解释GIF1和JANUS在根分生组织发育过程中的拮抗作用。为了验证这一假设，作者进行了体外下调试验(图8B)、酵母三杂交试验(Y3H)(图8C)和BIFC试验(图8D-E)。通过所有实验方法，作者确定GIF1抑制JANUS和Pol II之间的相互作用(图8B-E)。
图8.GIF1竞争性地将JANUS与Pol II捆绑在一起。(A)Y2H分析表明JANUS的RRM2结构域与GIF相互作用。正相互作用由合成的最小培养基-WLHA上的生长决定。结果表明，该方法具有三个生物重复性。(B)体外下拉实验显示，GIF1与JANUS相互作用，抑制JANUS与Pol II组分NRPB10之间的相互作用。实验进行了三次，结果相似。(C)具有代表性的Y3H实验表明，GIF1抑制JANUS与其相互作用的Pol II组分NRPB7和NRPB10之间的相互作用。(D-E)BIFC代表性CLSM图像(D)或YFP强度(E)分析表明，共表达GIF1-RFP可降低YN-JANUS与YC-NRPB7或YC-NRPB10之间的正相互作用，但不表达核标记蛋白U1-70K-RFP(洋红色)。箭头指向YFP阳性细胞核。A.U.A.。表示任意单位。(E)值为均值±标准差(n>11)。星号表示差异有统计学意义(t检验，P<0.05)。
为了提供GIF1和JANUS在根分生组织中的拮抗作用的遗传学证据，作者将GIF1功能丧失突变gif1或功能获得突变gif1导入JANUS-RNAi植物，并检测了所产生的遗传组合的根分生组织发育情况。根据相反的表型，下调gif1突变体中的JANUS导致根分生组织减少，使其与野生型相当(图9I-J，补充图9)。与测量的根分生组织长度一致，在JANUS-RNAi gif1植株中PLT1的丰度恢复到野生型水平(图9H)。相比之下，JANUS-RNAi植物中GIF1表达的增加导致根分生组织长度进一步缩短(图9I-J，补充图9)，PLT1丰度进一步降低(图9H)。为了确定GIF1和JANUS在根分生组织发育中的拮抗作用是否是通过PLT1转录介导的，作者通过检测野生型(图9A)、JANUS-RNAi(图9B)、gif1(图9C)、JANUS-RNAi gif1(图9D)、GIF1-OE(图9E)和JANUS-RNAi GIF1-RNAi GIF1的活性来检测PLT1的转录活性。对CFP信号(图9G)和RT-qPCR(图9H)的仔细检测证实了GIF1和JANUS对PLT1转录的拮抗作用。这些结果表明，JANUS和GIF1可能通过PLT1转录在根分生组织发育过程中发挥拮抗作用。
图9.GIF1和JANUS对PLT1转录和根分生组织发育起对抗性调节作用。(A-F)在Col-0(WT，A)、35Spro：JANUS-RNAi(RNAi-1，B)、gif1(C)、35Spro：JANUS-RNAi gif1(JANUS-RNAi gif1，D)、UBQ10pro：GFP-GIF1(GIF1-OE，E)和35Spro：JANUS-RNAi gif1(JANUS-RNAi gif1，D)中表达PLT1pro：CFP报告器的PI染色根的代表性CLSM图像。图像是CFP通道(绿色)和RFP通道(洋红色)的合并。(G)干细胞壁龛的CFP强度。A.U.A.。表示任意单位。数值为均值±标准差(n>20)。(H)PLT1的相对转录丰度。结果为均值±扫描电镜(n=3)。从5株DAG幼苗中提取RNA。(I-J)根分生组织的长度(I)或细胞数(J)。数值为均值±标准差(n>16)。(G-J)中不同字母表示两组间差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey's多重比较检验，P<0.05)。(K)一个工作模型，表明受IMB4调控的两种货物在PLT1的表达中起拮抗作用，从而在根分生组织的发育中发挥拮抗作用。
结论
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