科研 | COMPUT STRUCT BIOTEC：缺铁引起面包小麦转录组的变化
编译：Mr. Left，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
植物体内一系列复杂的转运，存储和调节机制控制着铁代谢，从而维持体内的铁稳态。尽管关于不同植物物种对缺铁响应的研究很多，但耕种最广泛的商业作物六倍体小麦的这些机制仍不清楚。在铁限制条件时，作者使用RNA测序揭示了小麦旗叶和根中的转录组变化。分别在旗叶和根中鉴定出5969和2591个差异表达基因（DEG）。在铁缺乏时，参与铁配体合成的基因，即烟草胺（NA）和脱氧麦根酸（DMA）显著上调。在根和旗叶中分别共有337和635个编码转运蛋白的基因表达发生变化。调节了与主要促进因子超家族（MFS），ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族，天然抗性相关巨噬蛋白（NRAMP）家族和寡肽转运子（OPT）家族相关的几个基因，表明它们在植物对抗缺铁胁迫中的重要作用。在调节因子中，编码碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的转录因子的基因在根和旗叶中均被上调。茉莉酮酸酯的生物合成途径显著变化，但根与旗叶之间的表达差异明显。同源物表达和归纳偏置分析揭示了亚基因组特异性差异表达。本研究结果提供了小麦响应缺铁胁迫的调控分子过程的综合概述，该结果可能成为育种耐缺铁胁迫作物及设计适当的小麦铁生物强化策略的指南。
论文ID
原名：Iron deficiency triggered transcriptome changes in bread wheat
译名：缺铁引起面包小麦转录组变化
期刊：Computational and Structural Biotechnology Journal
IF：6.018
发表时间：2020年9月
通讯作者：Navreet K. Bhullar
通讯作者单位：瑞士苏黎世联邦理工学院
DOI号：10.1016/j.csbj
实验设计
结果
在不同样本之间产生了12.92到2,509万的高质量的片段。其中，IWGSC小麦基因组装配RefSeq v1.0的HC基因比对有50.69％至70.34％的片段比对成功（附表1）。缺铁条件下，在旗叶中鉴定出5969个差异表达基因（FDR <0.05，倍数变化≥2），其中4226个基因上调，1743个基因下调（图1）。与旗叶相比，根样品的DEG数量（2591个基因）较少，其中有1186个上调基因和1405个下调基因（图1）。旗叶和根共享684个DEG，其中472个基因在两个组织之间表现出相似的表达模式。在这472个基因中，两个组织中的343个基因被上调，而129个基因被下调。其余的212个基因在旗叶和根之间具有相反的调控模式（图1）。此外，在缺铁的小麦植株中，叶绿素a和叶绿素b下降了近70％，类胡萝卜素下降了50％以上，这再次证明了缺铁胁迫处理的实施效果（补充图2）。
图1 缺铁条件下根和旗叶中的DEG数量。韦恩图显示了根和旗叶中的总DEG（FDR <0.05，倍数变化≥2）。绿色代表旗叶中的总DEG；蓝色代表根中的总DEG。向上的箭头表示基因表达的上调；向下箭头表示基因表达的下调。
|
Identifier |
Blast Hit |
Fold change |
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Roots |
Flag Leaves |
||
|
TraesCS2D02G425700 |
ERF4-like |
-3 |
2.47 |
|
TraesCS4B02G299400 |
TaERFVII.4-4B |
-3.36 |
-14.61 |
|
TraesCS2A02G288000 |
ERF113-like |
-2.27 |
7.07 |
|
TraesCS2A02G081300 |
PYE-like (bHLH47-like) |
6.85 |
13.41 |
|
TraesCS2B02G095900 |
PYE-like (bHLH47-like) |
17.6 |
25.79 |
|
TraesCS2D02G079100 |
PYE-like (bHLH47-like) |
10.86 |
8 |
|
TraesCS2A02G157800 |
PYE-like (bHLH47-like) |
2.5 |
3.99 |
|
TraesCS2D02G163900 |
PYE-like (bHLH47-like) |
2.66 |
4.12 |
|
TraesCS3A02G489600 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
433.99 |
2594.54 |
|
TraesCS3B02G550000 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
188.05 |
121.61 |
|
TraesCS3D02G495600 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
1291.76 |
413.83 |
|
TraesCS3A02G489500 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
108.42 |
203.98 |
|
TraesCS3B02G549800 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
1137.69 |
22.67 |
|
TraesCS3D02G495400 |
ORG2-like (bHLH38-like) |
61.39 |
36.01 |
|
TraesCS2A02G515300 |
bHLH100-like |
768.85 |
361.45 |
|
TraesCS2B02G543700 |
bHLH100-like |
271.83 |
234.78 |
|
TraesCS2B02G543800 |
bHLH100-like |
1106.44 |
165.75 |
|
TraesCS2D02G517000 |
bHLH100-like |
316.02 |
181.92 |
|
TraesCS3A02G489700 |
bHLH101-like |
19.18 |
94.19 |
|
TraesCS3B02G550200 |
bHLH101-like |
13.06 |
131.74 |
|
TraesCS3D02G495700 |
bHLH101-like |
8.18 |
488.49 |
|
TraesCS2A02G281200 |
FIT-like (bHLH29-like) |
10.71 |
22.23 |
|
TraesCS2B02G298600 |
FIT-like (bHLH29-like) |
5.47 |
20.73 |
|
TraesCS2D02G280100 |
FIT-like (bHLH29-like) |
14.65 |
8.8 |
|
TraesCS1A02G281300 |
ILR3-like (bHLH105-like) |
-2.66 |
-6.99 |
|
TraesCS1B02G290500 |
ILR3-like (bHLH105-like) |
-3.27 |
-18.47 |
|
TraesCS1D02G280600 |
ILR3-like (bHLH105-like) |
-2.61 |
-10.42 |
|
TraesCS6B02G220300 |
bHLH121-like |
-2.18 |
-13.93 |
|
TraesCS2B02G289900 |
TabHLH27 |
-7.51 |
11.69 |
|
TraesCS2D02G437600 |
PHL11-like |
2.48 |
2.24 |
|
TraesCS6B02G201700 |
TaMYB1 |
3.08 |
7.1 |
|
TraesCS3A02G367600 |
TaMYB41 |
-2.17 |
-3.33 |
|
TraesCS2D02G104500 |
WRKY72-like |
4.33 |
4.33 |
|
TraesCS2D02G104600 |
WRKY34-like |
11.13 |
31.34 |
|
TraesCS2D02G489700 |
WRKY70-like |
5.42 |
3.52 |
|
TraesCS5B02G183700 |
WRKY62-like |
3.98 |
8.29 |
|
TraesCS7A02G420400 |
bZIP10 |
-3.23 |
-3.5 |
|
TraesCS7B02G391800 |
bZIP9-like |
-2.41 |
-2.47 |
|
TraesCS7D02G475100 |
bZIP9-like |
-2.2 |
-4.22 |
|
TraesCS3B02G404800 |
LG2-like |
-2.86 |
-2.22 |
|
TraesCS2A02G467100 |
bZIP 27-like |
-3.21 |
-2.7 |
|
TraesCS2D02G324700 |
NAC 92-like |
-2.45 |
5.69 |
|
TraesCS5A02G143200 |
TaNAC69-3 |
-2.2 |
39.99 |
|
TraesCS4A02G131000 |
NAM-B1-like (NAC family) |
-2.24 |
3.77 |
|
TraesCS2D02G563000 |
DOF1.7-like |
-6.11 |
7.14 |
|
TraesCS2B02G592700 |
DOF1.7-like |
-6.02 |
17.98 |
|
TraesCS3A02G360300 |
SCL9-like |
3.74 |
3.64 |
|
TraesCS3D02G354100 |
SCL9-like |
3.17 |
4.59 |
|
TraesCS6A02G240400 |
HOX24-like |
-8.04 |
-5.55 |
|
TraesCS6D02G222600 |
HOX24-like |
-5.16 |
-4.03 |
|
TraesCS3A02G103500 |
TaDOG1L1 |
-2.4 |
2.22 |
|
TraesCS7A02G429300 |
Uncharacterized protein |
-3.21 |
-2.26 |
表1 编码根部和旗叶之间共享转录因子的差异表达基因（DEG）。该表列出了在缺铁条件下，编码转录因子（FDR <0.05，倍数变化≥2）并在根和旗叶之间共享的DEG。倍数变化的正数表示基因表达的上调。倍数变化的负数表示基因表达的下调。
图2缺铁小麦根和旗叶中的DEG的GO分析。DEG分为三个主要的GO类别：即BP（以蓝色表示）；MF（以绿色表示）；CC（以深橙色表示）。X轴表示每个GO术语中的DEG数量。（A）根部和（B）旗叶。
为了获得有关DEG的功能信息，通过GO富集分析并将DEG分为三类，即生物过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）。p值<0.001的GO术语被认为是显著富集的。对根DEG的GO分析显示，有19个BP GO术语显著富集（图2A；补充表2），这些GO术语中有一半以上与植物代谢和生物合成过程有关，例如“烟草胺生物合成过程”（GO：0030418），“木质素分解代谢过程”（GO：0046274），“苹果酸代谢过程”（GO：0006108），“谷氨酰胺代谢过程”（GO：0006541），“纤维素生物合成过程”（GO：0030244），“色氨酸分解代谢过程”（GO：0006569），“草酰乙酸代谢过程”（GO：0006107）,“茉莉酸生物合成过程的调节”（GO：0080141），“甲硫氨酸代谢过程”（GO：0006555），“细胞分裂素生物合成过程”（GO：0009691）等（图2A）。与转运或离子稳态相关的GO术语，即“跨膜运输”（GO：0055085），“金属离子转运”（GO：0030001），“细胞铁离子稳态”（GO：0006879）也富集，表明转运蛋白在铁缺乏时的重要作用。根特定的GO术语“侧根形成”（GO：0010311）暗示根的发育也对铁缺乏做出响应（图2A）。过表达的MF GO术语是“烟碱胺合酶活性”（GO：0030410），“铁离子结合”（GO：0005506），“苹果酸脱氢酶（NADP +）活性”（GO：0046554），“ATP酶活性与物质跨膜运动的耦合”（GO：0042626），“金属离子跨膜转运蛋白活性”（GO：0046873），“柠檬酸跨膜转运蛋白活性”（GO：0015137）表明铁螯合剂的合成和铁转运受到调节以维持铁稳态（图2A）。在CC GO术语中，“膜的整体组分”（GO：0016021），“细胞外区域”（GO：0005576），“质外体”（GO：0048046）富集在根部DEG（图2A）。通常，旗叶DEG GO术语的过表达与根部相似，只有几个GO术语例外（图2B；补充表2）。例如，BP GO术语“光合作用，光捕获“（GO：0009765），MF GO术语“叶绿素结合”（GO：0016168），“叶绿素b还原酶活性”（GO：0034256），CC GO术语“光系统I”（GO：0009522）和“光系统II”（GO：0009523）均表明，小麦在缺铁条件下的光合作用受到显著影响，这与旗叶中叶绿素含量的降低密切相关（补充图2）。这些结果突出了缺铁胁迫期间膜/膜局部金属离子转运蛋白以及调节蛋白和代谢蛋白的重要性。
参与NA和DMA合成的基因在根和旗叶中均被上调。一些NAS基因同源物被上调，根部的倍数变化高达298.3倍（TraesCS6D02G382900），旗叶的倍数变化高达1800倍（TraesCS5A02G552400）（图3；补充表3＆4）。同样，NAAT和DMAS基因同源物在根和旗叶中都被高度上调（图3；补充表4）。PS合成与甲硫氨酸的挽救途径有关，因为SAM是合成甲硫氨酸的关键前体，是由甲硫氨酸产生的。在根部和旗叶中，介导该途径中顺序反应的基因表达增加，表明甲硫氨酸的清除加速了（图3；补充表4）。上述基因表达水平的增加表明植物倾向于响应铁缺乏胁迫而增加NA和DMA的产量。
在缺铁状态下，根和旗叶中的三种铁蛋白同源物（TraesCS5A02G152400，TraesCS5B02G151000，TraesCS5D02G157600）的表达水平分别显著下降了4到10倍（补充表3和5）。但是，其中一个FERRITIN（TraesCS4B02G137200）基因在旗叶中上调了2.7倍。FERRITIN的表达减少，表明植物倾向于将可用铁分配到植物的不同部位，以对抗铁缺乏而不是储存。一些被标记为金属硫蛋白（MT）的基因的表达水平在根系和旗叶中都被改变，该基因编码参与离子存储和排毒的金属结合蛋白。大多数MT基因同源物在缺铁的根和旗叶中表达增加，变化分别高达679倍（TraesCS1B02G239400）和3.3倍（TraesCS3A02G531300）。相反，另外两个MT基因同源物（TraesCS1B02G042200和TraesCS3A02G074600）在缺铁根中分别下调了4.2倍和3.1倍。同样，两个MT基因同源物（TraesCS3D02G074400和TraesCS3A02G074600）的表达在旗叶中分别下调5.3倍和4.1倍（补充表3＆5），调节的MT在维持金属离子稳态中起着重要作用。
图3 根和旗叶中甲硫氨酸挽救和植物铁载体（PS）合成途径中的基因表达调控。红色和粉红色箭头分别代表根和旗叶中的基因表达上调。绿色和浅蓝色箭头分别表示在根和旗叶中下调表达的基因。蓝色和浅蓝色箭头的尺寸较小，表示下调基因的数量少于上调基因的数量。SAMS，S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶；NAS，烟酰胺合成酶；NAAT，烟酰胺胺转移酶；DMAS，脱氧麦根酸合成酶。
4 几个转运蛋白在缺铁胁迫期间协调有效的铁转运
GO富集和转录本丰度分析表明，在缺铁条件下，根和旗叶中的转运相关基因均受到显著调节（图2；补充表6）。在根中，编码转运蛋白和跨膜通道的337个基因被差异表达，并根据InterPro ID（补充表6）进一步分配给不同的蛋白家族。属于MFS的不同基因家族表现出可变的表达模式。在缺铁条件下，编码溶质载体家族40成员1（SLC40A1，铁调节的蛋白质/铁转运蛋白，IREG/FPN），锌诱导的类易化剂1（ZIFL）的基因以及高比例的编码硝酸盐转运蛋白1/肽转运载体（NRT1/PTR）家族的DEG显著上调，而一些编码硝酸盐转运蛋白和糖转运蛋白的基因被下调（补充表6），有37个成员差异表达，ATP结合盒（ABC）超家族包含来自ATP结合盒转运蛋白亚家族A（ABCA）家族，多药耐药蛋白（MRP，ABC转运蛋白C家族的成员）和多效药抗性（PDR）家族的上调基因。编码ABC转运蛋白的大多数下调基因都来自ABCG家族（补充表6）。类水通道蛋白（AQP）超家族是第三大被调节的组，有28个下调的DEG和2个上调的DEG。锌/铁渗透酶（ZIP）家族，OPT超家族，VIT家族，多抗菌挤压蛋白（MATE）家族，NRAMP家族和生长素输出载体（AEC）家族大多数上调。大约一半含有重金属相关（HMA）结构域的基因被上调，例如铜转运蛋白家族，而重金属转运/解毒超家族蛋白编码基因则大部分被下调（补充表6）。
与根相比，旗叶显示出更多的编码转运蛋白的DEG（635个基因）（补充表6）。旗叶中编码ABC转运蛋白和MFS家族的基因占编码转运蛋白的DEG的近30％。在115个MFS基因中，SLC40A1家族，ZIFL家族，糖转运蛋白家族，NRT1/PTR家族5.5和2.2被显著上调。在编码ABC转运蛋白的85个DEG中，ABCB家族，ABCC（包括MRP）家族，ABCG家族和PDR家族被显著上调。其他基因家族，例如MATE家族，HMA家族，OPT超家族，NRAMP家族和钾转运蛋白在旗叶中也被显著上调。例如，来自MATE和OPT家族的75％和91％的基因分别被上调。相反，超过90％的ZIP家族，77％的糖外排转运蛋白（SWEET）蛋白和68％的氨基酸转运蛋白家族基因在旗叶中被下调（补充表6）。
除了观察到的根和旗叶的差异外，在根和旗叶之间共享115种转运相关的DEG（补充表6）。MFS，ABC转运蛋白超家族，HMA，OPT，AQP，NRAMP和ZIP列为受调节基因（超级）家族中排名前七的家族（图4；补充表6）。超过20％的基因（25个基因）被归类为MFS。在25个MFS基因中，有19个在根和旗叶中的表达都高出2倍以上（补充表6）。
ZIFL基因家族的7个成员被上调，根部的表达变化在2.2到74.2倍之间，旗叶的表达在3到971.4倍之间。编码SLC40A1基因的两个基因（TraesCS7B02G270400和TraesCS7D02G365300）在根和旗叶中均具有较高的表达水平（图4；补充表3＆6）。NRT1/PTR家族5.5基因同源物，在根的表达水平增加了89.8倍，在旗叶的表达水平增加了21.8倍。4个基因（TraesCS7D02G197600，TraesCS1A02G197700，TraesCS2A02G205500和TraesCS2A02G284100）在根和旗叶中具有相反的表达（图4；补充表3＆6），其余两个基因（TraesCS1A02G211000和TraesCS2A02G204900）在两个组织中均下调（图4；补充表3＆6）。在编码ABC转运蛋白的基因中，3个ABCB基因同源物（TraesCS5B02G397600，TraesCS5D02G402600和TraesCS5A02G392700）在缺铁条件下表现出表达增加，其在根系表达范围为23.8至145.5倍，在旗叶范围为17.8至211倍。同样，ABCA，MRP和PDR基因同源物也显示出表达增加。然而，ABCG基因同源物在两个组织中均大部分下调，除了基因TraesCS5D02G257000，该基因在旗叶中表达上调了26.4倍（图4；补充表3和6）。总共，属于OPT超家族的13个基因同源物被调控。属于OPT超家族的12个基因，在根中的表达最高增加了441.5倍，在旗叶中增加了1230.9倍。然而，在两个组织中仅一个基因（TraesCS2A02G391000）表现出降低的表达水平（图4；补充表3＆6）。类似地，当处于缺铁条件时，5个NRAMP基因同源物在两个组织中均表达增加。对于AQP，ZIP和HMA家族的基因同源物，其表达模式是可变的，其中许多在根与旗叶之间显示出相反的表达模式（图4；补充表6）。这些结果进一步说明，铁的吸收和转运机制是由多种转运蛋白和离子通道介导的。这些转运蛋白似乎在缺铁条件下协调铁的分布，同时保持小麦的铁稳态。
图4 在根和旗叶之间共享的7个差异表达程度最大的转运蛋白编码基因家族。热图显示了7个差异表达程度最大的转运蛋白编码基因家族，分别在根和旗叶之间共享。白色至红色表示基因表达上调；白色到蓝色表示下调。MFS：主要易化子超家族；ABC：ATP结合卡盒；AQP：水通道蛋白；ZIP：锌/铁渗透酶；OPT：寡肽转运子；NRAMP：天然抗性相关巨噬蛋白；HMA：重金属结合相关。
5 控制小麦对铁缺乏响应的调控因子
总共有将近60％（108/179）的编码转录因子的DEG在根中被下调。相反，其中超过63％（231/366）在旗叶中显示出明显的上调（补充表7）。编码来自bHLH，NAC，MYB，碱性亮氨酸拉链（bZIP），WRKY和乙烯响应因子（ERF）家族的调节因子的基因对小麦的铁缺乏胁迫有响应，并占据了根和旗叶中相应DEG的73％以上。编码bHLH转录因子的DEG的大部分（占总bHLH家族同源物的78％）在根部上调，变化增加幅度为2.1倍至1291倍（补充表7）。bHLH转录因子基因家族在旗叶中也受到高度调节，差异表达的bHLH基因的67％被上调（补充表7）。根和旗叶共享26个bHLH DEG（表1），其中PYE（bHLH47）同源基因（TraesCS2A02G081300，TraesCS2B02G095900，TraesCS2D02G079100，TraesCS2A02G157800和TraesCS2D02G163900）的表达在根和旗叶中分别增加了至少2.5倍和3.99倍。ORG2（bHLH38）同源基因（TraesCS3A02G489600，TraesCS3B02G550000，TraesCS3D02G495600，TraesCS3A02G489500，TraesCS3B02G549800和TraesCS3D02G495400）的表达在根部和叶上分别上调表达在61-1291倍之间和91-2594倍之间。4个bHLH100同源基因，即TraesCS2A02G515300，TraesCS2B02G543700，TraesCS2B02G543800和TraesCS2D02G517000在根和旗叶中分别上调了271倍和181倍。在缺铁条件下，bHLH101同源基因在根和旗叶中分别表现出至少8.1倍和94.2倍的高表达。FIT（bHLH29）同源基因（TraesCS2A02G281200，TraesCS2B02G298600和TraesCS2D02G280100）的表达在根和旗叶中分别增加了5.5倍和8.7倍以上。IAA‐亮氨酸抗性3（ILR3/bHLH105）同源基因（TraesCS1A02G281300，TraesCS1B02G290500和TraesCS1D02G280600）和bHLH121同源基因（TraesCS6B02G220300）的根部下调了2.2倍，在旗叶中最多下调了18倍。但是，TabHLH27在根和旗叶中具有相反的表达模式。
与bHLH基因家族不同，其他大型转录因子家族大多在根中下调。例如，根部下调了97％的ERF特异性DEG，78％的MYB DEG，89％的bZIP DEG和67％的NAC基因。相反，75％的WRKY基因在根中显示出上调。在旗叶中，编码NAC和WRKY转录因子的基因分别上调了96％和100％。MYB和ERF基因在旗叶中具有几乎相等比例的上调和下调DEG。与根部相似，在旗叶中85％的bZIP基因的表达被抑制（补充表7）。总共34和24个ERF基因分别在根和旗叶中差异表达（补充表7）。然而，这些ERF基因中只有3个在根和旗叶之间共享（补充表7）。根和旗叶中的TraesCS4B02G299400分别被抑制了3.3倍和14.6倍。TraesCS2D02G425700和TraesCS2A02G288000在根中的表达降低，但在旗叶中上调（表1）。与ERF基因相似，两个组织之间仅共享4个WRKY转录因子基因。所有这4个共享的WRKY DEG（TraesCS2D02G104500，TraesCS2D02G104600，TraesCS2D02G489700和TraesCS5B02G183700）均被上调，而类WRKY34在根和旗叶分别被上调11倍和31倍（表1）。根与旗叶之间共享5个bZIP基因，并且被下调多达4.2倍。根和旗叶共享3个NAC DEG，但在根部中至少有2.2倍的下调，在旗叶中类TaNAC69-3基因上调39倍。鉴于铁缺乏胁迫期间观察到的高表达变化，与NAC，WRKY，bZIP，ERF和MYB相比，bHLH似乎是受调控程度最高的基因家族（表1；补充表7）。在上述转录因子中观察到的差异和高表达变化表明它们在控制小麦中缺铁响应中的调节作用，并指出了一个复杂的调节网络。特别地，在根和旗叶之间共享的转录因子表明对缺铁胁迫的更系统的响应。
6 茉莉酸酯的生物合成因缺铁而改变
茉莉酸（JA）是将分子响应和生理反应联系在一起的重要信号分子。在本研究中，铁缺乏胁迫显著影响JA的生物合成（图5）。通常，JA的生物合成途径在旗叶中被上调，其中编码脂肪酸脱氢酶（FAD）的基因的表达增加高达85倍（TraesCS6D02G260300）（补充表3和8）。6个磷脂酶A1（PLA）基因中有4个表现出表达的增加，在旗叶中表达范围为2.2到58倍。所有差异表达的脂氧合酶（LOX），丙二烯氧合酶（AOS），丙二烯环化氧化酶（AOC）基因在旗叶中均表达上调。在旗叶中，LOX基因同源物的表达高达513倍（TraesCS5D02G013400）。在旗叶中，AOS基因同源物被上调至54倍（TraesCS4B02G237600）。此外，在缺铁小麦旗叶中还观察到了12-氧-植物二烯酸还原酶（OPR），4-香豆酸辅酶A连接酶（OPCL），3-酮脂酰辅酶A硫解酶（KAT）和茉莉酸O-甲基转移酶（JMT）的表达增加了2倍以上。有趣的是，在缺铁条件下，小麦根部的茉莉酸生物合成相关的基因（例如PLA，LOX和OPCL）被显著下调（图5）。4个AOS基因中的3个基因在根中的表达也显示出下调。但是，除一个基因（TraesCS5A02G186200）外，所有FAD基因在根中均被上调（补充表3＆8）。这些结果表明，JA是促进小麦铁稳态维持的重要信号分子。
图5 根和旗叶中的茉莉酸酯生物合成途径中的基因表达调节。红色和粉红色箭头分别代表根和旗叶中的基因表达上调。蓝色箭头表示根中基因表达下调。
7 DEG的共表达分析
建立了共表达网络以通过关联和聚类小麦基因进而揭示基因之间的关联。仅考虑具有至少20个基因的模块。总共产生了303个包含82,600个基因的模块，占小麦HC基因总数的76.5％（图6A）。通过超几何检验评估每个模块中旗叶和根中DEG的富集。模块90和模块300分别在根和旗叶中被评为最丰富的DEG模块（补充表9）。模块90包含94个基因，其中78个基因在根中差异表达，50个基因在旗叶中差异表达。GO分析表明Module 90与烟碱胺合酶活性有关（GO：0030410），在铁的获取，转运或储存中起重要作用。它包含23个类NAS基因，7个类ZIFL基因，5个类NAAT基因，3个类YSL基因，3个类SLC40A1基因，2个类DMAS1基因，2个类ZIP基因，2个类FER基因，（图6B，补充表9）；属于该模块的旗叶中的所有DEG均被上调，在缺铁条件下，观察到模块90的78个根中的77个DEG均被上调。属于该模块的基因表达量的增加表明对这些基因有较强的协同反应，以对抗缺铁胁迫。模块300是DNA结合（GO：0003677）相关的模块，其仅包含20个基因。但是，这些基因中的19个在根中差异表达，而这些基因中的20个在旗叶中差异表达。该模块中包含10个类bHLH基因，其中5个类bHLH038基因，3个类bHLH101基因和2个类bHLH039基因。模块300中的所有基因均显著上调，根部上调高达1291倍（TraesCS3D02G495600），旗叶上调高达2594倍（TraesCS3A02G489600）（图6C，补充表9）。这些结果进一步表明bHLH家族的转录因子以及模块90和300中的基因在维持小麦体内铁稳态中的作用。
图6 小麦中的基因共表达网络。（A）面包小麦中的基因共表达网络概述。小麦中的基因共表达网络被聚类为模块。前50个模块（在每个模块中按基因编号排序）均标有颜色。在所有模块上进行的超几何检验表明，模块90（B）和模块300（C）分别是根和旗叶中最丰富的DEG模块。粉色节点（两者）表示在根和旗叶中均差异表达。绿色节点（旗叶）仅表示在旗叶中的差异表达。蓝色节点（根）仅表示在根中的差异表达。灰色结节（NE）表示在任一组织中均未检测到差异表达。节点的大小表示此模块中一个基因与其他基因的相互作用。尺寸越大，交互作用就越强。
8 同源物归纳偏置分析
将DEG分配给三个小麦亚基因组，它们具有相似的DEG数量，其顺序为在根中A基因组（869）>D基因组（850）>B基因组（836）>未知（36）；在旗叶D基因组（2072）>B基因组（1920）>A基因组（1886）>未知（91）。为了了解当小麦遭受缺铁胁迫时是否存在同系物表达或归纳偏置，将DEG分配给三联体基因（如果存在三个同系拷贝），双联体基因（如果存在两个同系拷贝）或单基因（如果仅检测到一个同源拷贝）。在DEG中，1957个基因分布在根部的1464个三联体中，而4506个基因分布在旗叶中的3023个三联体中（图7）。只有176个三联体在根中被观察到，这三种同源物都差异表达。而三联体87、114、107在AB，AD和BD亚基因组组中分别具有两个差异表达的同源物拷贝。另外，三联体345、316和319分别只在亚基因组A，B和D中有一个差异表达同源物拷贝（图7A）。与根相似的是，546个三联体在含有3个同源物拷贝的旗叶中表达差异。在AB，AD和BD亚基因组组中差异表达的同源基因具有两个拷贝，分别对应于185、263、275三联体。总而言之，根部约88％的三联体和旗叶中约82％的三联体具有归纳偏置。此外，在所有三个同源物均被差异表达的三联体中，大多数DEG在三个亚基因组之间似乎以非常相似的方式被调控（补充图3）。
图7 响应铁缺乏条件的同源物归纳偏置。（A）缺铁条件下根部的同源物归纳偏置。（B）铁缺乏条件下旗叶的同源物归纳偏置。黄色，蓝色和粉红色圆圈分别表示在亚基因组A，B和D中差异表达的三联体基因。维恩图中的数字表示三联体仅具有一个差异调节的同源物拷贝（非重叠区域）；具有两个基因差异调控的三联体（两种颜色之间的重叠区域）；或所有三个基因均受差异调节的三联体（三种颜色之间的重叠区域）。
讨论
尽管土壤中铁含量很高，但是土壤中的高pH和碳酸钠等条件会影响植物对铁的摄取和吸收，从而对农产品产生不利影响。同样从人类营养学的角度出发，同样有必要研究控制铁吸收和转运的机制，以设计有效的生物强化策略来解决缺铁性贫血。植物对铁缺乏的响应已在非淀粉类植物如拟南芥和禾本科植物（包括水稻）中得到了广泛研究。迄今为止，已经进行了一些研究来表征小麦中与铁稳态相关的基因。然而，从小麦遭受缺铁胁迫的转录组学研究中获得的信息非常有限，尤其是在籽粒充实发育阶段。
1 缺铁时铁螯合剂的产量增加
植物中的铁稳态是由各种铁配体，转运蛋白和调节因子共同参与和严格控制的。通常，铁与配体结合用于转运或储存，以减少游离铁产生有毒ROS的风险。因此，铁配体的产生通常取决于可用于摄取和/或转运的铁的量。在水稻根中，缺铁会上调OsNAS1，OsNAS2，OsNAS3，OsNAAT1和OsDMAS1，这表明其在铁的吸收以及NA和DMA的转运中起重要作用。除了用作DMA生物合成的关键中间体外，NA还是一种铁螯合剂，可与亚铁和三价铁形成稳定的络合物，用于共质体和长距离铁转运。DMA还是多功能铁配体，也用于木质部以及韧皮部中铁的长距离转运。本研究的数据还表明NA和DMA的产量增加。在铁缺乏胁迫期间，小麦根和旗叶中参与PS合成的关键基因，即NAS，NAAT，DMAS被上调，这与以前在小麦和水稻中的发现是一致的。结果也与通过qRT-PCR分析的19种预选Fe稳态相关基因的结果非常吻合。作者观察到缺铁期间小麦根中S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶（SAMS）的表达上调，与水稻中的OsSAMS1和OsSAMS2相似。相反，当比较缺铁和对照生长条件时，在大麦中未观察到SAMS表达的变化。黄瓜根部的蛋白质组学研究甚至显示SAMS蛋白减少。
2 小麦中的铁转运需要一系列转运蛋白的协同作用
多种转运蛋白在细胞间和细胞内植物铁转运中起重要作用，这些蛋白质的协同作用对植物的生长和发育至关重要。在缺铁条件下，小麦旗叶和根中的许多转运蛋白基因家族受到显著差异调控，例如MFS，ABC转运蛋白家族，MATE，OPT超家族和NRAMP家族。MFS与ABC转运蛋白一起是整个生命领域的两个通用转运蛋白超家族。作为最大的二级运输载体超家族，MFS促进了各种物质的运输，例如氨基酸，肽，药物，核苷酸以及铁螯合物等。MFS家族成员TOM1将DMA输出到土壤中，并参与DMA内部铁转运到水稻植物的韧皮部和木质部。缺铁的水稻根系中锌诱导的促进因子OsZIFL4，OsZIFL5，OsZIFL7和OsZIFL12上调，表明它们在铁转运中的作用。尽管ZIFLs的表达在水稻叶片中没有改变。就小麦而言，观察到旗叶和根中大部分ZIFL（包括TOM基因）的表达均增加。但是，当小麦缺铁时，旗叶中的两个ZIFL基因（TraesCS5B02G137400，TraesCS4A02G218000）被抑制了，这可以通过另一项在小麦上的研究得到证实。作者还检测到铁缺乏条件下，根和旗叶中SLC40A1基因的表达增加，这与拟南芥中观察到的响应相似。这些结果表明，MFS基因在面包小麦中的铁运输中起着重要作用，并且各个亚家族成员以协调的方式参与其中，可能发挥不同的功能来维持总体铁稳态。
ABC超家族是最大的主要活性转运蛋白家族之一，可转运矿物质离子，脂质和肽，因此对于代谢物的输入和输出至关重要。在铁缺乏时，小麦根和旗叶中的几个属于ABC转运蛋白家族的基因受到显著调节。据报道，在缺铁条件下，NtPDR3在烟草悬浮细胞中的表达增加。同样，据报道属于ABC转运蛋白B家族的OsABCB14基因是一种生长素转运蛋白，可影响水稻植株的铁稳态。在植物中，据报道MRP基因将植酸转运到液泡中。在哺乳动物细胞中，MRP1被鉴定为谷胱甘肽（GSH）共轭转运蛋白，并与NO介导的铁外排有关。同样，本研究的数据确定了编码ABC转运蛋白的几个小麦同源基因，这些基因在缺铁条件下在小麦根和旗叶中受到差异调节，并暗示它们直接和/或间接参与铁转运。
已知植物MATE家族位于液泡和质膜中，主要促进次生代谢物和异生物素的运输。据报道，MATE转运蛋白可介导柠檬酸流入水稻，大豆和拟南芥的根部脉管系统，因此可提高植物铁的转运效率。作者还观察到了几种MATE基因在根和旗叶中的表达增加。这些差异表达的MATE转运蛋白似乎对小麦中Fe（III）-柠檬酸的转运很重要。
已经在拟南芥，水稻和玉米中研究了转运蛋白家族，如OPT，NRAMP和ZIP家族。作为特征明确的金属转运蛋白家族之一，OPT家族的YSL转运蛋白已证明参与土壤中铁的吸收，韧皮部的长距离转运以及发育种子中的铁转运。NRAMP家族也被认为是重要的金属转运蛋白家族，其中一些基因参与通过液泡和质膜的铁转运。同样，ZIP家族也涉及二价金属（如铁，锌和锰）的转运。在缺铁条件下，小麦中来自OPT，NRAMP和ZIP家族的基因表达受到显著调节，表明在小麦的长距离和/或细胞内铁转运中具有相似的作用。
3 复杂的调控和信号网络控制铁稳态
在调控因子中，bHLH转录因子家族是涉及植物铁稳态相关基因调控的最被广泛报道的其中之一。对于水稻，IRO2调节负责DMA合成和铁转运的基因的表达，例如OsNAS1，OsNAS2，OsNAAT1，OsDMAS1，OsYSL15和TOM1。在这项研究中，水稻OsIRO2同源物的表达在根和旗叶中被上调，表明在小麦中具有类似的调节作用。在缺铁条件下，拟南芥中的bHLH38和其他三个Ib亚组bHLH转录因子bHLH39，bHLH100和bHLH101均在叶片和根中都被上调。据报道，bHLH38，bHLH39，bHLH100和bHLH101与类FER缺铁诱导的转录因子（FIT bHLH29）形成异二聚体，为了调节拟南芥中编码三价铁螯合还原酶（FRO2）和铁调节转运蛋白（IRT1）的基因。除FIT外，另一种重要的bHLH转录因子POPEYE（PYE），即OsIRO3直系同源物，正调控植物的生长和发育，并作为某些铁稳态相关基因（例如NAS4，ZIFL1和铁还原氧化酶3（FRO3））的转录阻遏物。在本研究中，发现一些bHLH成员（包括bHLH38，bHLH100，bHLH101，FIT和PYE的同源物）在缺铁条件下被上调，表明小麦和拟南芥中缺铁响应的类似调节机制。ILR3和bHLH121是上游转录因子，可以调节许多其他与铁稳态相关的转录因子。ILR3可以与IVc bHLH同源物bHLH34，bHLH104和bHLH115形成同型和异型二聚体，从而诱导Ib bHLH转录因子的表达。同样，PYE同源物bHLH121通过与ILR3相互作用来激活Ib bHLH转录因子和PYE编码基因的表达。根和旗叶中ILR3和bHLH121同源物的下调表明小麦中存在复杂的调控网络（表1）。为了深入了解铁稳态调节机制，有必要进行进一步的实验。
另外，bHLH调节网络与信号通路相连。一种是茉莉酮酸酯信号。茉莉酮酸酯是衍生自脂质的植物激素，其源自多不饱和脂肪酸的氧化代谢。它们起信号分子的作用，并参与各种生理反应以调节发育过程或对环境刺激作出响应。在铁限制生长条件下，大豆茉莉酸的生物合成发生了变化。已观察到茉莉酮酸酯可抑制在铁的获取或转运中起作用的铁缺乏诱导基因的表达水平，例如拟南芥根中的IRT1和FRO2，水稻根中的OsNAS1，OsDMAS1和TOM1。然而，据报道，JA信号在非常早期的缺铁响应期间在水稻根部被激活，但在长期的缺铁处理后被减弱或消失。茉莉酮酸酯通过抑制FIT，bHLH38，bHLH39，bHLH100和bHLH101基因的表达来抑制缺铁反应。本研究观察到在缺铁条件下小麦根部JA生物合成相关基因的下调。另外，衰老的拟南芥叶片中的内源JA水平升高，并伴随着与JA生物合成相关基因例如LOX1，LOX3，LOX4，AOC1的上调。同样，JA的生物合成相关基因在旗叶中的表达升高，表明在缺铁胁迫下，JA可能在缺铁胁迫下促进小麦叶片衰老，并加速铁在叶片和谷粒之间的转运。然而，编码调节乙烯产生的关键酶的基因的表达模式，即1-氨基环丙烷-1-甲酸（ACC）合酶和ACC氧化酶，并不表明乙烯的产量增加，乙烯是植物叶片衰老和果实成熟的已知助剂。为了进一步了解JA在小麦缺铁响应中的作用，需要更多的生理和生化研究，例如，测量不同小麦器官中内源JA的浓度，或通过应用外源JA评估缺铁响应可能是有益的。此外，在缺铁的情况下，JA与其他激素信号网络（如生长素和乙烯）之间的相互作用将是一个有趣的科学问题。
NAC和WRKY转录因子家族均参与调节非生物胁迫已被广泛报道，例如寒冷，干旱，盐胁迫等。据报道，NAC家族中的某些因子也调节小麦和水稻中的铁转运。NAC家族成员，铁缺乏响应性顺式作用元件2（IDE2）结合因子（OsIDEF2）与OsYSL2启动子区域结合并调节OsYSL2的表达。在WRKY家族中，OsWRKY80与铁过量时的基因调控有关。在缺铁的水稻根中观察到OsWRKY17的基因表达增加。另外，据报道OsWRKY45的表达在水稻茎中上调。本研究还检测到许多NAC和WRKY家族成员的表达水平升高，尤其是在叶片中，这表明它们在维持小麦铁稳态中的调节作用。
结论
RNA测序数据揭示了小麦在缺铁胁迫期间受调控的基因，并反映了几种铁配体，转运蛋白的作用以及涉及铁稳态的调节机制。观察到蛋氨酸清除和PS合成的加速，这可能是由于缺铁条件下对铁螯合剂（如NA和DMA）的需求增加所致。包括MFS，ABC转运蛋白，OPT，NRAMP家族在内的几个基因家族受到了显著调控，从而促进了铁的有效转运。转录因子，尤其是bHLH家族，对根部和旗叶的缺铁响应活跃，并可能促进JA信号转导与缺铁响应之间的联系。在同源三联体DEG中检测到归纳偏置。此外，基因共表达网络阐明了参与小麦铁稳态相关的基因关系。这些观察为进一步研究小麦中缺铁胁迫响应以及未来的生物强化计划奠定了重要的基础。
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