科研 | PLANT MOL BIOL：转录组分析揭示玉米体细胞胚胎发生相关的信号通路和基因表达调控（国人佳作）
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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作者通过对玉米愈伤组织和体细胞胚胎进行转录组分析，揭示了玉米体细胞的基因重编程，信号通路和转录调控的信息。
体细胞胚胎广泛作物的繁殖和基因工程等方面。作者实验室已构建了能够产生完成体细胞胚胎的自交系Y423，并应用于遗传转化。为了深入理解玉米体细胞胚胎的调控机制，作者使用转录组测序对玉米自交系Y423幼胚（IE）、胚性愈伤组织（EC）和体细胞胚胎（SE）进行了研究。三个差异分组（IE-vs-EC，IE-vs-SE和EC-vs-SE）鉴定到的差异表达基因（DEGs）分别为5767，7084和1065。DEGs的表达模式主要分为8个簇。体细胞胚胎发生相关的基因主要聚集在A和B两个簇，在脱分化过程中呈上调表达。GO和KEGG分析表明，DEGs参与植物激素信号转导、应激反应和代谢过程。涉及的转录因子家族与胁迫反应、细胞分化、胚性模式和胚胎成熟过程有关。此外，候选基因的时间表达模式分析揭示了他们在体细胞胚胎发生中的作用。这些转录数据为今后的功能研究提供了见解，这将有助于进一步剖析控制玉米体细胞胚胎发生的分子机制。
论文ID
原名：Transcriptomic analysis reveals somatic embryogenesis‐associated signaling pathways and gene expression regulation in maize(Zea mays L.)
译名：转录组分析揭示玉米体细胞胚胎发生相关的信号通路和基因表达调控
期刊：Plant Molecular Biology
IF：3.302
发表时间：2020年8月
通讯作者：原亚萍
通讯作者单位：吉林大学植物科学学院
DOI号：10.1007/s11103-020-01066-z
实验设计
结果
为了全面了解玉米体细胞胚胎发生的相关基因，作者将对幼胚，愈伤组织和体细胞胚胎构建了cDNA文库，组织培养见图1。设置三个生物学重复，数据质控结果表明，9个样本的Q30均大于90%，说明测序数据质量较好，可用于下一步分析。各个样本的数据量大概为11M到14.5M。对测序数据进行指控，将过滤后的clean read比对到玉米参考基因组上，大概有77%的数据是唯一比对，说明所选玉米参考基因组合理。
图1. 玉米体细胞胚胎发生的不同时间阶段。A为未成熟胚胎。B-D为三个脱分化阶段。E为愈伤组织黑暗条件下培养20天。F为愈伤组织在继代培养基上培养30天后，愈伤组织表面产生的体细胞胚胎。G为显微镜下观察愈伤组织。H为体细胞胚胎在分化培养基上胚胎7天。
2 鉴定差异表达基因
使用Deseq2鉴定差异表达基因。三个分组（IE-vs-EC，IE-vs-SE，EC-vs-SE）的差异表达基因情况见图2A。IE-vs-EC分组中鉴定到5767个DEGs，其中有3907个上调转录本。在IE-vs-SE分组中鉴定到4162个转录本上调和2922个转录本下调。在EC-vs-SE分组中鉴定到1065个DEGs，其中有121个上调转录本。韦恩图展示了三个差异分组中上调和下调的基因数量以及共有和特有的基因数量（图B和图C）。这些数据表明体细胞胚胎发生过程是一个高度复杂的过程。
3 差异表达基因的功能注释和分类
对DEGs记性GO注释，鉴定到的所有DEGs共注释到53个GO terms，主要分为三大类，分别为生物过程，细胞组分和分子功能（图3）。高度富集的GO terms主要有盐胁迫反应（GO:0009651）、氧化应激反应（GO:0006979）、激素介导的信号通路（GO:0009755）、激素响应（GO:0009725）、生长素激活的信号通路（GO:0009734）、信号转导（GO:0007165）、代谢过程（GO:0008152）、蛋白质二聚活性（GO:0046983）、转录调节区DNA结合（GO:0044212）、转录正调控、DNA模板化（GO:0045893）、脂肪酸生物合成过程（GO:0006633）、离子转运（GO:0006811）、谷胱甘肽代谢过程（GO:0006749）、谷胱甘肽转移酶活性（GO:0004364），细胞（GO:0005623）和核小体（GO:0000786）。这些结果表明，在玉米体细胞胚胎发生过程中，胁迫反应、植物激素反应、信号转导、活性代谢和活性细胞增殖可能在改变细胞命运方面发挥重要作用。
图3. GO注释，分为生物过程，分子功能和细胞组分三大类。x轴表示GO terms，y轴表示DEGs数量在鉴定到的基因所占的百分比。
为了进一步确定DEGs在玉米体细胞胚胎发生过程中的作用，作者进行KEGG分析。1166（IE-vs-EC）、1475（IE-vs-SE）和229（EC-vs-SE）分别注释到122、124和84条KEGG通路（图4）。根据先前的研究，KEGG富集的通路主要涉及代谢和物质积累，包括碳代谢（zma01200）、淀粉和蔗糖代谢（zma00500）、氨基糖和核苷酸糖代谢（zma00520）、脂肪酸代谢（zma01212），柠檬酸循环（zma00020）等。这些注释信息可为研究体细胞胚胎发生的特定途径和功能基因提供有用信息。
图4. 主要富集的KEGG通路
4 DEGs聚类分析
为探讨玉米体细胞胚胎发生过程中的基因共调控模式，对三对比较的DEGs进行了下游聚类分析。根据表达模式的相似性，使用层次聚类算法将8282个DEGs分为8个主要的簇（图5）。下调的基因主要富集在簇E,F,G和H中，而上调基因主要富集在簇A,B,C和D中。簇G在三个分组下都呈下调趋势。然而，在去分化过程中簇A和簇B均是上调表达。簇A,B和D中的基因高度富集在次级代谢生物合成，转运和分解代谢，信号转导等过程。
图5. DEGs的聚类分析。绿色代表表达量低，红色代表表达量高。
5 qRT-PCR验证
为了进一步验证转录组测序结果的准确性，作者选择了22个差异表达基因进行了qRT-PCR分析（图6）。其大部分基因的表达模式类似。两种方法的表达水平不同核能是由于测试平台不同和算法不同造成的。总的来说，表达模式类似也表明了转录组分析数据的真实性。
图6. DEGs数据与qRT-PCR结果的比较。A，IE-vs-EC；B，IE-vs-SE；C，EC-vs-SE。
6 玉米体细胞胚胎发生过程中转录因子的差异表达
在鉴定到的8282个差异表达基因中，共有703个转录因子（TF）差异表达。图7展示了TF的功能分类和注释。各个分组TF家族的表达水平不同。在玉米体细胞胚胎发生过程中，最常见的代表家系为ERF、bHLH、MYB、WRKY、NAC、bZIP、C2H2、HD-ZIP和ARF。
图7. TF家族的分类及差异表达基因的分布情况。A，转录因子家族的分布情况。B，TF在8个簇中的分类。
7 涉及体细胞胚胎发生的DEGs
为了了解调控玉米体细胞胚胎发生的分子机制，作者根据文献进行了深入研究，以确定参与体细胞胚胎发生的候选基因。利用玉米B73的氨基酸序列相似性，对玉米中已鉴定出的其它物种的基因进行了同源性鉴定。
由各种植物激素和胁迫相互作用诱导的体细胞胚胎需要在染色质水平上进行广泛的遗传重编程。应激相关基因和蛋白，包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）、GLP和几丁质酶等，都参与体细胞胚胎发生。对玉米中的GST进行了全面分析。根据基因和蛋白质序列相似性，作者鉴定出19个在去分化过程中差异表达程度较高的玉米GST基因（表1）。其中11个玉米GST基因分为A组，其余10个归为B组。
表1. 差异表达的玉米谷胱甘肽-S-转移酶基因
已有研究表明大量激素反应和生物合成相关基因参与体细胞胚胎发生。根据序列相似性，作者发现玉米Zm00001d014690的蛋白序列与AtARF7的同源性为46.05%。ZM0000114690在三个分组下表达量均上调。Zm00001d051891、Zm00001d047921和ZM00001D2767的氨基酸序列相似性分别为52.76%、54.83%和46.97%。其中ABA诱导基因参与胚胎成熟期。玉米晚胚发生丰富蛋白Lea5-D样亚型ZM00001D00660被归为B群。AP2/B3样转录因子家族蛋白ABI3（Zm00001d001838）在体细胞胚胎发生过程中上调，并被归为C.M.truncula体细胞胚相关因子1（MtSERF1）是必需的有助于体细胞胚胎的发生，并可能使压力和发育之间有联系。
对胚胎发育的诱导和维持非常重要的信号分子已经在一些物种中被鉴定出来。体细胞胚胎发生受体样激酶（SERK）基因参与体细胞胚胎发生过程中的信号转导途径。在本研究中，ZmSERK1（Zm00001d025580）、ZmSERK2（Zm00001d016928）和ZmSERK3（Zm00001d050868）在体细胞胚胎发生中表达水平没有明显变化。
在DEGs中有一些参与胚胎基因途径的启动或胚胎的形成和发育的转录因子。已有研究表明AGL15在体外过度表达可增强体细胞的胚性反应。本研究中发现了与AGL15序列高度相似的基因，即ZmMADS56（Zm00001d027425）、ZmMADS1（Zm00001d048474）和ZmMADS11（Zm00001d036425）与拟南芥AGL15氨基酸序列的相似性分别为45.45%、39.91%和45.75%。
8 体细胞胚胎发生过程中候选基因不同时间的表达模式
进一步研究候选基因ARF35、BBM、BAK1、EMB、ZmPIN1a、ZmLAX3、ZmMADS11、LBD42和ZmYUCCA5。在体细胞胚胎发生过程中，ARF35与LBD42共表达，相关系数为0.881。这两个基因在本研究中高表达，并在0-5天时表达水平显著增加。随后，它们在后期略有下调，但在EC15时上调至峰值,表明这两个基因可能参与了胚性途径的启动。玉米体细胞胚发生过程中ZmYUCCA5上调，并在SE中达到表达水平峰值。ZmPIN1a和ZmLAX3在体细胞胚胎发生过程中显著上调。玉米体细胞胚发生过程中，BBM、BAK1、ZmMADS11和EMB均上调。这些研究表明，这些基因参与了玉米胚性途径的发生、胚胎形成和发育。
图8.玉米体细胞胚胎发生不同阶段候选基因不同时间的表达模式。在qRT-PCR中，每个样品有三个生物重复。
讨论
作者实验室筛选出一株体细胞胚胎诱导率高、再生能力强的优良玉米自交系Y423，并将其有效地应用于作物遗传工程中。不同于以往的研究，作者本次分析重点研究体细胞向胚性转化的整个过程。利用转录组测序技术对玉米自交系Y423诱导玉米体细胞胚胎的信号同化和转录调控进行了大量研究。大量基因在去分化过程中表现出明显的差异表达（IE vs EC）。在比较EC和SE时鉴定到1065个DEGs，其中大多数是下调表达。共有8282个DEGs被聚为8个簇，并鉴定了与应激反应、激素反应/转导和生物合成、信号转导或代谢相关的基因。大多数与胚性能力有关的基因被分为A或B群。此外，对49个转录因子家族中703个差异表达的转录因子进行了分析。最常见的TF家族与“共同应激反应”有关或在细胞分化、胚性模式形成和胚胎成熟过程中起作用。此外，对候选基因的不同时间表达模式进行了详细的描述，以揭示它们在玉米体细胞胚胎发生中的作用（图9）。
图9. 玉米体细胞胚胎发生过程中调控网络中主要候选基因相互作用的模型
1 应激诱导基因参与细胞命运转换
胁迫是一种信号，可以引导植物细胞进行去分化，作为适应手段，并为基于刺激获得新的细胞命运做准备。作者的转录组数据表明，在玉米体细胞胚胎发生过程中，多种胁迫应答转录因子都有差异表达，其中大部分可分为A、B两类。本研究将脱分化过程中发生较大变化的TFs分为几个主要的TF家族，包括ERF、bHLH、MYB、WRKY、NAC、bZIP、C2H2、HD-ZIP和ARF。在本研究中，作者鉴定到19个在玉米脱分化过程中差异表达的GST基因。作者的研究发现GSTs是在生长素作用下表达的。这与之前的研究结果一致。本研究中GST的表达模式显示，当EC或SE与IE比较时，大多数差异表达的GST表达上调，而SE与EC相比则下调。Germin/GLP基因表达可由生物或非生物胁迫诱导，并参与发育调控。作者的研究结果表明，这些GLPs可能在玉米体细胞胚胎发生中起着特殊的作用。需要进一步的研究来探索它们的生物学功能。
2 激素在胚胎发生中的重要作用
各种植物激素在植物离体胚胎发生中起着重要作用。生长素和细胞分裂素是植物细胞分裂和分化的关键调节因子，能促进体细胞获得胚性能力。乙烯、脱落酸（ABA）和生长素都是一种应激激素，可能在体细胞胚胎发生中起到积极作用。本研究发现，激素应答和生物合成基因参与了玉米体细胞获得胚性潜能的过程。
本研究中，作者用qRT-PCR研究了ZmYUCCA5不同时间的表达模式，发现在体细胞胚胎发生过程中，ZmYUCCA5在SE时间点表达量达到高峰。植物胚胎发生过程中需要PIN生长素外排转运蛋白和生长素内流载体AUX1和类AUX1蛋白。
乙烯对体细胞胚胎发生的影响很复杂。在一些研究中，乙烯被报道对不同物种的胚胎培养产生负面影响。在玉米组织培养中，硝酸银作为乙烯的抑制剂也可以提高产量。ERF家族的一些成员参与了体外应激反应和发育过程的调控。在本研究中，AP2/ERF基因在脱分化过程中表现出不同的表达模式。玉米基因Zm00001d002762在玉米脱分化过程中上调，其蛋白质序列与MtSERF1相似34.55%，与AtSERF1相似42.96%。这表明Zm00001d002762在玉米胚芽发生中起着积极作用。研究表明ABA在合子胚和体细胞胚的胚胎发育和成熟过程中起着重要作用。
3 胚胎发生途径启动和发育中的转录调控
大规模的转录分析旨在探索与胚胎发生有关的分子机制，已经鉴定出一些基因，包括在胚胎发生过程中起调节作用的转录因子。然而，与玉米有关的信息相对较少。作者的玉米胚性组织培养起始转录组数据将有助于更好地理解玉米体细胞胚胎发生过程。在本研究中，703TFs在体细胞胚胎发生过程中差异表达。最常见的家族是bHLH、ERF、WRKY、NAC、bZIP、MYB、HD-ZIP、C2H2和ARF。据报道，这些TF家族与“共同应激反应”相关或在细胞分化、胚胎发生模式和胚胎成熟中起作用。这些结果表明，这些转录因子家族的成员可能在玉米体细胞胚胎发生过程中起关键作用。
据报道，AP2/ERF家族的几个成员参与了小孢子、体细胞和合子胚胎的发生。本研究将3个玉米BBM基因（Zm00001d017207、Zm00001d042492和Zm00001d046913）分为B组，用qRT-PCR分析了其中一个BBM基因（Zm00001d017207）不同时间的表达模式。BBM表达水平从第0天到第10天显著升高，并在EC15达到高峰。
茎尖分生组织（SAM）和根顶端分生组织（RAM）的形成是胚胎发生过程中最关键的过程。含有转录因子WUSCHEL（WUS）的同源域是胚胎中SAM启动的早期分子标记，是干细胞形成和维持所必需的。在作者的研究中，WUS基因表达最少。本研究还鉴定和分析了LEC和AGLs。拟南芥中的LEC1被认为是胚胎特性的关键调节因子。在本研究中，AGL15样基因，包括ZmMADS56（Zm00001d027425）、ZmMADS1（Zm00001d048474）和ZmMADS11（Zm00001d036425），在两个差异分组（IE与EC、IE与SE）中的表达变化超过16倍。这些结果表明，AGL15类基因对玉米胚性愈伤组织的发生和维持也有重要作用。
结论
综上所述，本研究为玉米胚性组织培养系统提供了完整的转录组数据，以研究控制体细胞胚发生的分子机制。利用转录组测序技术，对三个差异分组进行了研究，分别鉴定到了5767、7084和1065个DEGs。并对这些DEGs进行了GO和KEGG分析。共将8282个DEGs基因分为8个簇，并将多个体细胞胚胎发生相关基因分为A或B组，在营养细胞向体细胞胚转化过程中，表达呈上调趋势。另外，从49个转录因子家族中鉴定到703个差异表达的转录因子成员。本研究中涉及次生代谢、信号转导、激素反应和胁迫反应的基因可能是进一步分析其在玉米体细胞胚胎发生中作用的候选基因。最后，分析了体细胞胚胎发生过程中不同时间基因的表达水平。本研究的转录组数据将有助于更好地理解与玉米体细胞胚胎发生有关的基因组信息。
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