综述 | MicroRNAs：病原体与宿主相互作用的生物调节因子
编译：有点卡，编辑：十九、江舜尧。
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MicroRNAs（miRNAs）作为一类具有调控基因表达作用的非编码的小分子RNA，在近十几年里得到了广泛的关注和应用，在细胞分化和发育、免疫反应、凋亡等多种生物进程的转录后水平调节中发挥着重要作用。近年来miRNAs在炎症和免疫反应中的重要作用也逐渐被重视，其中宿主miRNAs的调节被证明与传染病、感染的根除和易感性有关。本综述对miRNAs的生物学功能进行了回顾，着重阐述了miRNAs在利什曼原虫、锥虫、弓形虫和疟原虫与宿主相互作用中作为基因表达调控因子的作用，并对炎症免疫反应基因表达的调控进行了展望。
论文ID
原名：MicroRNAs: Biological Regulators in Pathogen–Host Interactions
译名：MicroRNAs：病原体与宿主相互作用的生物调节因子
期刊：Cells
IF：5.656
发表时间：2020.01
通讯作者：Sandra Marcia Muxel
通讯作者单位：巴西圣保罗大学生理学系
DOI号：https://doi.org/10.3390/cells9010113
主要内容
1. 引言
非编码RNAs（ncRNAs）的发现使分子生物学领域发生了革命性的变化，虽然这些ncRNAs并不编码蛋白，却能影响整个基因组的稳定和基因的表达。可以根据RNAs的长度、位点和功能进行分类：如调控基因表达的ncRNAs可以分为长链非编码RNAs（lncRNAs）、微小RNAs（miRNAs）、小干扰RNAs（siRNAs）以及PIWI相互作用RNAs（piRNAs）；成熟RNAs可以分为小核仁RNAs（snoRNAs）和小核RNAs（snRNAs）；与蛋白质合成相关的RNAs可分为核糖体RNA（rRNAs）和转运RNA（tRNAs）等。
miRNAs（通常含有21个核苷酸）是一种ncRNAs，作用于信使RNA（mRNAs）的3’非编码区（3’UTR），从而使mRNAs降解或阻遏翻译。miRNAs参与包括慢性疾病、感染性疾病在内的多种生物过程，具有复杂性，能同时与RNA结合蛋白（RBPs）等多种分子相互作用，使RNA诱导沉默复合物（RISC）更容易进入miRNA识别位点，使初代miRNAs或lncRNAs得以加工，从而控制不同位点基因的表达通量。
宿主与病原体的相互作用使宿主细胞发生信号和生理改变，诱导在免疫应答诱导过程中参与炎症反应的基因发生miRNA介导的转录后调控，这些miRNAs能同时参与初级和次级免疫反应的调节。近年来关于miRNA在细菌、病毒和寄生虫引起的传染病和癌症中的表达调控已得到广泛研究。
有报道提出可以将病人血浆中的miRNAs作为一种潜在的临床诊断非侵入性生物标记物，这促进了对病人血浆中肿瘤衍生miRNAs的研究。此外，有研究表明肝中毒、冠心病和感染性疾病中miRNAs的表达存在差异。
本综述阐述了miRNA对病原-宿主相互作用中不同生物学过程的调节，重点介绍了原生动物寄生虫感染引起的相互作用，如利什曼原虫属（Leishmania spp.）、锥虫属（Trypanosoma spp.）、弓形虫属（Toxoplasma spp.）和疟原虫属（Plasmodium spp.），并对炎症免疫反应基因表达的调控进行了展望。新兴的miRNA组学（miRNomics）具备新的数据库和计算工具，为病原体、脊椎动物和无脊椎动物宿主的miRNA提供了新的见解，为研究宿主-病原体相互作用提供了新方法。
2. miRNA的生成及基因表达调控
miRNAs是一种基因与基因间区域以单顺反子或多顺反子（miRNA簇）的形式转录出的转录本，可以有自己的启动子区域，也可以依赖于宿主基因（基因内源的）；在外显子或内含子区域编码，并按前体mRNA相同的方向利用mRNAs的启动子区域进行转录（图1）。miRNA通过RNaseII转录并折叠成长的双链初代miRNA（pri-miRNA），随后在细胞核中，由RNaseⅢ超家族的DROSHA与DGCR8（一种双链RNA结合蛋白，也被称为Pasha）形成的复合物识别其发卡结构，并将其加工成前体miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA与Exportin5蛋白结合后离开细胞核进入胞浆，在细胞质中由RNaseⅢ超家族的Dicer与TRBP（转录激活相应元件RNA结合蛋白）识别，并将其加工为成熟的miRNA——miRNA-duplex，最后，成熟miRNA的功能链作为核糖核蛋白（RNP）复合物（miRNPs）的重要组成部分与AGO（argonaute）结合，并与靶mRNA相互作用，从而调节基因的表达。
miRNAs以序列特异的方式在转录后水平调控基因的表达，具有巨大的生物学影响。目前，很多研究正在探索由miRNA介导的转录后调控机制，将近30%哺乳动物细胞的蛋白编码基因已经通过体内外、无细胞提取物以及生物信息学预测工具等方式证明miRNA的假定调控。miRNA转录后调控的方式有：（a）阻遏7-甲基鸟苷（m7GpppN）修饰的mRNA 蛋白翻译的起始，抑制真核翻译起始因子（eIF）亚基eIF4E，eIF4F和eIF4G的结合，从而抑制核糖体起始复合物与mRNA结合；（b）由AGO2-Dicer-TBBP复合物介导通过干扰eIF6与60S的结合，防止核糖体60S亚单位与40S和mRNA的结合；（c）通过miRNA-mRNA与活性多聚体的结合阻断延伸，影响翻译的启动后过程。miRNAs还可以通过招募衰变机制元件使得mRNA降解，导致mRNA poly(A)尾去烯化，通过3’ →5’的外切活性使mRNA的poly(A)尾巴去嘌呤从而降解，或通过5’ →3’的外切活性使mRNA脱帽从而降解。此外，miRNAs还可以作为外泌体被分泌至囊泡中，并进入细胞外液循环，这一性能表明胞外miRNAs在介导细胞间通信和作为多种疾病（包括传染病）的生物标记物方面具有潜能。
图1 miRNAs的生成。miRNAs是一种单顺反子或多顺反子DNA序列转录而成的小型非编码RNAs，在外显子、内含子或特殊的看家基因中均有miRNAs的存在。转录后得到的新的RNA序列称为pri-miRNA，随后被折叠成发卡结构并与DGCR8和Drosha核糖核酸酶结合成的微型处理器相连，pri-miRNA被这一微型处理器切割后成为pre-miRNA；之后，pre-miRNA与Exportin 5（EXP5）结合形成复合物后被运到细胞质中，由Dicer捕获并切割，释放出两个成熟的miRNA臂，此时成熟的miRNA-Dicer复合物便可以与AGO和TRBP蛋白结合组装成RNA诱导的沉默复合物（RISC），组装完成后的RISC便能寻找其靶点—mRNA，且一旦找到，mRNA便会沉默，基因的表达便得到了调控。
3. miRNA在传染病中的表达
3.1 利什曼原虫（Leishmania）与宿主间的相互作用
利什曼病（Leishmaniases）是一种媒介传播疾病，有20多种利什曼原虫（一种原生寄生虫）能使人类致病，具有多种临床表现：症状仅局限于皮肤或粘膜表面的皮肤表现；寄生虫迁移到内脏器官（如肝、脾和骨髓）后的内脏损害。利什曼病是一种被忽视的热带疾病，在全世界98个国家流行，其中皮肤利什曼病的年发病率约为70-120万，内脏利什曼病的年发病率为20-40万。利什曼原虫生活史由两种形态交替：寄生在沙蝇（白蛉（Phlebotomus）和罗蛉（Lutzomyia））消化道内进行胞外复制的前鞭毛体形态（Promastigotes Form）；以及寄生在哺乳动物宿主吞噬细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞（DCs））吞噬体内部的无鞭毛体形态（Amastigote Forms）。利什曼原虫被吞噬细胞吞噬后，炎症反应便开始了，其能够通过抑制炎症反应和适应性免疫反应来影响免疫过程。最近，有研究表明，亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）、婴儿利什曼原虫（L. infantum）、硕大利什曼原虫（L. major）和杜氏利什曼原虫（L. donovani）的感染能引起人、鼠和狗的巨噬细胞和树突状细胞miRNA谱改变，表明miRNA与宿主对寄生虫的识别和免疫应答的激活机制有关。
免疫反应调节是一个复杂的网络，在确定利什曼原虫的感染、调节T CD4+淋巴细胞在Ⅰ型（Th1促炎）或Ⅱ型（Th2抗炎）感染中的极化等方面是必不可少的，此外，巨噬细胞极化也与此有关。Th-1细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和/或Toll样受体（TLR）配体，负责将巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞，增加利什曼原虫活性的一氧化氮合酶2（NOS2）的表达和NO产生；另一方面，Th-2细胞因子和趋化因子，如白细胞介素4（IL-4）、IL-13、肿瘤生长因子β（TGF-β）、IL-10和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），将巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞表达更多精氨酸酶1（ARG1），有利于寄生虫存活。一些在感染过程中被调节的miRNA与巨噬细胞极化有关，如M1型（miRNA-146和miRNA-210）和M2型（miRNA-130a、miRNA-130b、miRNA-155、miRNA-21、miRNA-19a、miRNA-23a、miRNA-125a、miRNA-125b、miRNA-26a、miRNA-26b和miRNA-720）。小鼠巨噬细胞的转录谱显示，在感染亚马逊利什曼原虫的小鼠巨噬细胞中存在混合的M1/M2型巨噬细胞，一旦C57BL/6巨噬细胞上调Il1b，在BALB/c巨噬细胞中则观察到Il1b的差异下调，Il1b是一种介导一氧化氮（NO）产生并抵抗利什曼原虫感染的分子。
有趣的是，寄生虫的一些毒力因子干扰miRNA机制，调节宿主mRNA的表达。如在杜氏利什曼原虫中，糖蛋白gp63靶向宿主的Dicer1，切割Dicer以下调pre-miR-122，并促进miR-122的产生，从而发生宿主mRNA-miRNA相互作用的转录后调节，导致小鼠肝脏负担增加，如图2所示。亚马逊利什曼原虫的精氨酸酶（一种利用L-精氨酸产生鸟氨酸和尿素的酶）的活性可影响感染期间巨噬细胞miRNA的表达调控。一旦NOS2利用L-精氨酸产生NO，宿主和寄生虫的精氨酸酶对L-精氨酸的利用使得激活宿主微生物反应的氨基酸可用性发生改变。L-精氨酸缺乏导致T细胞中的CD3ζ链下调，从而抑制T细胞反应。事实上，miR-122抑制阳离子氨基酸转运体（CAT1）可以调节细胞内L-精氨酸的浓度；此外，miR-155抑制DC中精氨酸酶2的表达，防止L-精氨酸耗竭，并促使T细胞活化。
图2 miRNA在利什曼原虫与寄主相互作用中发挥的作用。利什曼原虫感染导致哺乳动物宿主患利什曼病。感染开始于被感染的雌性沙蝇（白蛉或罗蛉）吸血的过程，利什曼原虫在沙蝇的肠道中以可移动的胞外前鞭毛体形式增殖，随后前鞭毛体被注入宿主的表皮，并被免疫原细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞识别。一旦利什曼原虫被这些免疫细胞吞噬，它们就会分化为无鞭毛体，并开始在这些细胞内繁殖。无鞭毛体形态鞭毛减少且呈卵圆形，存活于吞噬细胞内。前鞭毛体形态的利什曼原虫表达的非编码RNA（ncRNAs）可以调节无脊椎动物宿主-沙蝇的代谢途径。此外，沙蝇也会表达miRNAs影响寄生生物在沙蝇消化道内的定殖，并促进寄生虫在脊椎动物宿主体内向感染型分化。当然，不仅是在无脊椎动物宿主中，在脊椎动物宿主中利什曼原虫也表达miRNAs。人单核细胞源性巨噬细胞（MDM）或小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）以及人和狗外周血细胞（PBMCs）的实验模型表明，利什曼原虫对哺乳动物宿主的感染可以干扰宿主miRNAs的分布，而且利什曼病患者的血浆或皮肤病变部位样本也显示miRNA谱存在改变。
此外，寄生虫可以影响杀菌机制的激活（如产生NO），还能将细胞募集到病变部位。研究表明，亚马逊利什曼原虫诱导BALB/c-BMDM中miR-294-3p和miR-721的上调，并与Nos2的3′UTR结合，减少NOS2和NO的生成，增加感染性。同时，miR-30e和miR-302d等miRNA在感染过程中去调控，干扰Nos2 mRNA的表达和NO的产生；miR-294和miR-302d调节Tnf的mRNA水平，miR-294调节Ccl2/Mcp-1 的mRNA，表明这些miRNAs的表达能控制感染性。事实上，对于一组miRNAs，let-7a、miR-25、miR-26a、miR-132、miR-140、miR-146a和miR-155，它们在硕大利什曼原虫感染人巨噬细胞中的上调与它们相应的趋化因子靶向CCL2、CCL5、CXCL10、CXCL11和CXCL12的表达呈负相关，从而证实趋化因子CCR2、CCL5和CXCL10在感染期间下调。同样，缺氧诱导因子-1（HIF-1α）的激活部分控制了被硕大利什曼原虫感染的人巨噬细胞中的miR-210，将HIF-1α的过表达与杜氏利什曼原虫和亚马逊利什曼原虫的易感性均联系起来。这种机制是通过下调NF-κB介导的促炎性细胞因子基因（如TNF-α和IL-12）的转录来实现的，从而改变了寄生虫在巨噬细胞内引起的免疫应答。有趣的是，miR-21在杜氏利什曼原虫感染的外周血单个核细胞（PBMCs）中上调，miR阻断增加了杜氏利什曼原虫感染小鼠DCs中IL-12mRNA的表达，导致CD4+T细胞增殖。此外，miRNA-361-3p（一种TNF调节因子）与巴西利什曼原虫（L. braziliensis）引起的局部皮肤利什曼病（LCL）皮肤损伤呈负相关，巴西利什曼原虫对五价锑具有一定抗性，被感染患者损伤部位的miR-193b和miR-671的表达与它们各自的靶基因（CD40和TNFR）的表达相关。
犬内脏利什曼病（Canine Visceral Leishmaniasis）是由婴儿利什曼原虫感染引起，有症状感染犬的PBMCs的 miR-150、miR-451、miR-192、miR-194和miR-371表达存在差异调节，它们的靶基因可以影响免疫应答和发病，如NF-κB、TNF-α、CD80和IFN-γ，它们是与抵抗疾病有关的重要分子。被婴儿利什曼原虫感染的人类U937和THP-1单核源性巨噬细胞的miR-346上调，进而降低最初与降低MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子的抗原呈递、TAP1、RFX1和BCAP31相关基因的mRNA水平。
寄生虫可以模拟凋亡信号（如著名的凋亡样利什曼原虫）或减少CD4 T细胞的增殖，从而解除宿主的自噬机制以激发抗炎反应或改变抗原呈递。miR-101c、miR-129-5p、miR-155和miR-210-5p等miRNAs在硕大利什曼原虫感染的BMDM中呈现差异表达，与自噬机制的激活和寄生虫清除的干扰有关。杜氏利什曼原虫感染的THP-1和人MDM可上调miR-30a水平，从而对Beclin 1（BECN1）产生负调控作用，增加自噬机制，从而降低感染性。同样地，感染杜氏利什曼原虫的小鼠巨噬细胞通过表达miRNA-3473f抑制自噬。
此外，miR-511在杜氏利什曼原虫感染的DCs中上调，进而干扰Toll样受体4（TLR4，识别和激活利什曼原虫感染免疫应答的重要分子）信号。此外，杜氏利什曼原虫对盐酸依米丁（Sodium Stibogluconate，一种在印度次大陆治疗内脏利什曼病五价含锑药物）具有抗药性，能上调小鼠巨噬细胞中靶向MyD88的miR-466i的表达，增加IL-10的产生和疾病的严重程度。本实验室的研究表明，let-7e、let-7f和let-7g在亚马逊利什曼原虫感染期间以依赖于MyD88、TLR2或TLR4的方式上调，let-7e的阻遏增加了NOS2 mRNA的表达、NOS2蛋白的数量和NO的产生，从而影响感染性。此外，在亚马逊利什曼原虫感染期间let-7e的阻遏会上调已验证靶点Tnfpaip3、Map2k4、Tbk1和Tnf的水平，以及预测靶点Traf6、Ppara、Mapk8ip3/Jip3、Map3k1和Ube2n的水平，对TLR信号基因的表达产生全局性影响。有趣的是，分枝杆菌（Mycobacterium）和奈瑟菌（Neisseria）的感染会导致巨噬细胞中let-7e水平上调。实际上，let-7e靶向p65 NF-κB激活、磷酸肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Pi3k/Akt）和TLR4，减少促炎细胞因子（如TNF、IFN-α和IL-6）和趋化因子（MCP-1、MIP-1和IP-10）的表达。
一些研究证实转录因子和miRNA的整合对宿主免疫应答有调节作用。杜氏利什曼原虫增加了人MDMs中c-Myc转录因子的水平，导致DROSHA的上调和let-7a、miR-151、miR-34a、miR-98、miR-148b和miR-378a的下调，而c-Myc的敲除改变了这些分子的表达调控模式并降低了寄生虫的存活率；c-Myc过表达维持了M2极化（如人类肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）），调节了血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、HIF-1α和转化生长因子β（TGF-β）的表达。
Geraci等表明let-7a、let-7b和miR-103在感染杜氏利什曼原虫的树突状细胞和巨噬细胞中上调，但在感染硕大利什曼原虫中下调；参与炎症的靶向基因及miRNA的表达也可以控制干扰素的调节，证明利什曼原虫在确定感染结果和miRNA谱方面的重要性。总的来说，利什曼原虫可以诱导miRNA谱的广泛变异，这与靶基因转录和宿主细胞类型相关，表明miRNA调控中的物种特异性和在利什曼原虫感染期间病原体的宿主识别与miRNA-mRNA相互作用有关。
在无脊椎动物宿主方面， miRNAs的调节有利于病原体的存活和传播，白蛉是公认的利什曼原虫和各种病原体（细菌、病毒）的传播媒介。杨致远和吴艺林将长须罗蛉（Lutzomyia longipalpis，一种美洲利什曼病载体）的miRNA与其它非编码RNA区分开来，并提出miRNA靶向基因在利什曼病感染中的作用，如llo-miR-9388-5p和llo-miR-3871-5p在恶毒白蛉（Phlebotomus perniciosus，一种欧洲婴儿利什曼原虫的主要载体）中的作用。
如亚马逊利什曼原虫、巴西利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和硕大利什曼原虫所示，计算算法预测和RNA序列分析均证明利什曼原虫中存在ncRNAs，这表明ncRNA可能在基因表达调控中起作用，有助于我们了解基因组结构，以及前鞭毛体和无鞭毛体形态下的转录表达和调控。然而，只有巴西利什曼原虫具有功能性RNA干扰途径和AGO1。
3.2 锥虫（Trypanosoma）与宿主间的相互作用
恰加斯病（Chagas disease,又称美洲锥虫病）是另一种被忽视的热带疾病，由寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，是一个影响到全世界600-700万人（WHO）的重大公共卫生问题，尽管近年来恰加斯病发病率有所下降，但仍是一个令拉丁美洲头疼的问题。不仅如此，该病在加拿大、美国、欧洲、澳大利亚和日本等非流行地区也有报道，主要通过输血、器官移植、纵向传播（Vertical Transmission，即母婴感染）或意外摄入传播；在南美洲，克氏锥虫主要是通过被感染的吸血锥蝽臭虫（Triatominae bugs）的粪便传播。这种疾病的特征是寄生虫侵入血液，感染包括心肌细胞在内的不同组织细胞。该病分为急性和慢性两个临床阶段，从无症状的非特异性症状到心肌病、消化道功能障碍或神经系统紊乱，且两个阶段免疫系统都会被激活。在急性期，免疫系统激活抑制寄生虫的复制和感染；相反，在慢性期，与寄生虫有关的几个调节级联反应和自身免疫以及持续性的炎症反应将被启动。疾病的进展和严重程度可根据个体、地理区域和寄生虫组织趋向而变化，呈现可影响宿主-病原体相互作用的特定基因型和表型特征。目前可用的治疗方法苄硝唑（Benznidazole）和硝呋替莫（Nifurtimox）在40多年前开始使用，但这两种药物都有一定的局限性，例如治疗时间长，主要对急性疾病有效。因此需要新的有效治疗方法和预后指标。
心脏和心肌组织的基因表达谱显示，慢性恰加斯病患者以及急性和慢性克氏锥虫感染小鼠之间的差异表达基因可能受到调控。这些差异表达基因与免疫反应、能量代谢以及细胞应激反应有关。炎症反应包括激活TLRs级联信号，诱导T细胞产生IFN-γ，以及B细胞产生抗体减少寄生虫病，随后又由IL-10抵消。尽管存在先天性和适应性反应，但低级别的慢性感染可浸润Th1细胞，从而在心肌组织中产生IFN-γ并导致心脏损伤。
miRNAs在恰加斯病中的作用也被描述为生理和病理因子的基因表达调控作用。包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和浸润的炎态细胞在内的心脏组织细胞之间的相互作用，以及miRNA跨这些细胞转移的可能性，代表miRNAs和mRNAs之间的复杂联系，影响了对感染和发病的抵抗。
克氏锥虫感染的小鼠心脏miRNAs的调节与感染后30天（dpi，days post-infection）的原虫血症（parasitemia）峰呈正相关，如miR-146b、miR-21、miR-142-3p和miR-142-5p，而与miR-145-5p和miR-149-5p以及参与感染的基因和病理生理条件（如钙钾通道和心电图（ECG）参数）呈负相关，如图3所示。miR-133和miR-208的失调与慢性恰加斯患者和急性克氏锥虫感染小鼠的心血管疾病相关的心脏基因有关。Ferreira等人表明有些miRNA在整个心脏组织中表现为上调，如小鼠试验模型中被克氏锥虫感染的急性阶段（15dpi）和慢性阶段（30dpi和45dpi）中的miR-155-5p，以及感染慢性阶段的let-7a-5p均表达上调，这种miRNA调节模式与Nrf2转录响应和氧化应激相关。此外，miR-149-5p、miR-138-5p和miR-16-5p在克氏锥虫感染过程中通过调节浸润细胞（infiltrating cells）中的IFN-γ和NFR2调节基因的表达而出现差异表达，从而控制寄生状态和组织损伤。
慢性恰加斯病患者血浆样本中miR-208a水平的升高与TGF-β介导心肌肥大和纤维化相关基因的调控有关。Nonaka等人还发现，慢性恰加斯病患者血浆样本中的miR-19a-3p、miR-29b-3p和miR-30a-5p，以及心脏样本中miR-19a-3p、miR-21-5p、miR-29b-3p、miR-30a-5p、miR-199b-5p和miR-208a-3p水平的升高，与TGF-β介导的成纤维细胞miR-21上调有关。这些miRNAs可以调节不同的基因和机制，如miR-193b靶向TGF-β2，miR-338靶向凋亡相关酪氨酸激酶（AATK，apoptosis-associated tyrosine kinase）诱导凋亡，此外，还有促炎性细胞因子的诱导，如人脂肪细胞中由TNF-α和IL-6介导的miR-199a上调。
被克氏锥虫感染的B6小鼠胸腺内，参与T细胞分化的胸腺上皮细胞（TEC）的miR-10a水平升高，这可能是TGF-β信号转导引起的，使得胸腺在感染期发生萎缩。克氏锥虫的基因组和转录组分析显示存在包括snRNA、snoRNA和tRNA在内的ncRNA（图3）。事实上，sncRNAs可以通过寄生虫的胞外囊泡进入HeLa细胞（一种宫颈癌细胞的细胞系），从而增加易感性。
图3 在恰加斯病和昏睡病中miRNA对锥虫、载体与哺乳动物宿主之间相互作用的影响。克氏锥虫引发的恰加斯病在锥蝽臭虫吸血时传播，并在锥蝽臭虫排便的时候以锥鞭毛体（Trypomastigote form）的形态转移到脊椎动物宿主体内，由于虫子叮咬引发皮肤瘙痒，使锥虫进入真皮，感染各类细胞，并从锥鞭毛体分化为无鞭毛体，感染并在细胞内复制，引发一系列的临床症状。克氏锥虫表达的小非编码RNA（sncRNAs）能改变无脊椎动物宿主（锥蝽）的基因表达调控。此外，克氏锥虫的感染可改变被感染人或小鼠的心脏细胞、被感染小鼠胸腺上皮细胞以及人血浆样本中循环miRNAs的表达，引发心肌病、寄生虫病和免疫应答。而昏睡病是由布氏锥虫（T. brucei）引起，这种寄生虫在被感染的采采蝇（Tsetse flies）吸血的过程中以锥鞭毛体的形式进入到脊椎动物宿主体内。与克氏锥虫感染不同，布氏锥虫在血液、淋巴和脊髓液中循环，可以穿过血脑屏障感染中枢神经系统，这种寄生虫表达与毒力因子（如各种表面糖蛋白）表达调控相关的miRNAs，且布氏锥虫感染患者血浆中miRNA谱发生了改变。
布氏冈比亚锥虫（T.brucei gambiense）和罗得西亚锥虫（T.b.rhodesiense）的感染能导致人患一种被称为非洲昏睡病（African sleeping sickness）的慢性疾病，分别流行于西非和东非。布氏锥虫通过被感染的采采蝇的叮咬传播，以哺乳动物宿主（人、家畜和反刍动物）体内的血液型和昆虫型两种形式交替。寄生虫的入侵会引起宿主的局部炎症反应，出现轻微的红肿，而寄生虫在血浆和细胞间质中增殖会引发急性发热性疾病。布氏冈比亚锥虫感染的典型症状是颈淋巴结肿大，可发展为神经系统疾病，如脑膜炎、嗜睡和昏迷。而罗得西亚锥虫主要引起急性全身性疾病，如血液淋巴紊乱、淋巴结肿大、发烧、暴瘦等。布氏锥虫在血液中通过抗原变异来逃避宿主的免疫反应。有趣的是，在被布氏冈比亚锥虫感染的患者血液样本中miR-193b和miR-338上调，miR-199a-3p和miR-27b呈阳性。通过布氏锥虫转录组鉴定其ncRNAs，对这些分子的描述可以提高我们对寄生虫生物学的认识。在布氏锥虫中预测到881种miRNAs，包括编码相同前体的miRNAs基因组簇，如miR-1-2、miR-4~12和 miR-84~106，这些基因簇能影响寄生虫转化和增殖的不同阶段的毒力因子，如变异表面糖蛋白（VSG）。布氏锥虫具有功能性RNAi和AGO1机制，但在克氏锥虫、硕大利什曼原虫和杜氏利什曼原虫并不存在功能性RNAi机制。
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种普遍存在的寄生虫，能感染多种宿主，包括小鼠、人、猪、鸟、羊和猫，其中猫是能让弓形虫进行有性繁殖的终宿主。弓形虫的生命周期复杂且取决于宿主：当它无性繁殖时，寄生虫呈现两种形式：速殖子（tachyzoites）和裂殖子（bradyzoites，又称缓殖体），因繁殖速度快慢得名，其中裂殖子可以经包囊包被并长期休眠，直到宿主免疫受损。宿主摄入生的被感染肉或随猫粪脱离的卵囊后，感染便开始了，随后寄生虫开始它漫长的旅程，入侵尽可能多的细胞进行复制。不得不说弓形虫是一种非常成功的寄生虫，一部分原因是它能悄无声息的定殖在宿主体内，尽管包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞和NK细胞在内，几乎所有类型的免疫细胞都被招募来抵抗弓形虫的感染，但几乎所有的感染仍是无声的。弓形虫能够改变宿主的miRNA谱，改变宿主对感染的响应方式。此外，寄生虫还启动了自己的miRNA处理机制和miRNA。
2010年首次发表的关于这一课题的研究，将原代HFFs细胞（Human Foreskin Fibroblasts，人类包皮成纤维细胞）的miRNA谱与弓形虫感染联系起来。如图4所示，这项研究证实了被感染细胞中两个簇存在上调：miR-17-92 (miR-17, miR-18, miR-19a, miR-20a, miR-19-b1,和miR-92-1)以及miR-106b-25 (miR-106b, miR-93和miR-25)。有趣的是，两个簇中的部分miRNAs均具有相同的种子序列，这表明这些miRNAs与HFF细胞中相同类型的过程调节有关。2014年另一组研究表明，miR-17~92簇在人巨噬细胞中的表达依赖于STAT3（信号转导和转录激活因子），这些miRNAs可以通过抑制BIM（促凋亡分子）来抑制细胞凋亡。这种抑制凋亡的机制是目前已知的弓形虫逃避免疫反应的途径。许多研究表明miR-17-92簇与包括癌症、自身免疫病、炎症甚至慢性疾病的免疫发病机制在内的多种细胞过程有关。该簇通过MIR17HG（miR-17宿主基因）在人体内编码，其开放阅读框的转录由c-Myc、HIF1和许多其他与炎症相关的转录因子调控。此外，该miRNA簇的功能与B细胞和T细胞的增殖和分化有关。miR-17~92能促进免疫细胞（如B细胞和T细胞）的增殖：miR-17~92能促进T细胞的增殖、并分化为辅助性T细胞，肖常春等人也表明该簇与调节性T细胞的分化有关，小鼠miR17hg宿主基因突变导致淋巴增殖性疾病和自身免疫，正是因为调节性T细胞的分化减少；对于B细胞，早期祖B细胞中Dicer的条件性缺失使pro-B细胞向pre-B细胞的分化受到阻遏，引起miR-17~92靶点特别是促凋亡Bim分子上调，这些研究结果再次表明该簇与细胞凋亡的调控有关。
图4 弓形虫与宿主miRNA相互作用的生命周期。弓形虫具有复杂的生命周期，能够感染家猫、家畜、小鼠等多种动物，甚至能感染人类，其中猫是弓形虫的终宿主。卵囊从被感染的猫粪便中释放出来，在外界形成孢子，变得具有感染性。人类也可以通过食用被感染动物未煮熟的肉或在护理被感染的猫时被感染，被感染的人将患弓形虫病，这是一种影响骨骼肌、心肌和大脑等各种器官组织的疾病。最终使被感染患者的神经细胞、单核巨噬细胞和成纤维细胞miRNA表达发生改变。此外，被感染猫的肝脏样本和被感染猪的肺泡巨噬细胞和脾细胞样本的miRNA谱也被改变。弓形虫的研究通常以小鼠为模型，因为小鼠可以在自然条件下感染寄生虫并影响多个器官，同时能改变miRNA谱，目前已知在感染过程中miRNA谱发生变化的器官包括脾脏、血浆和大脑。用方框的颜色表示miRNAs表达的增加（红色）或减少（绿色）。
miR-17-92和miR-106-25并不是在感染寄生虫后唯一被修饰的miRNA，许多其他研究已经证明，宿主的miRNA表达模式可以被修饰。在猪体内弓形虫的感染能导致被感染细胞的全基因组miRNA改变：被国内的弓形虫YZ-1株（IX型）感染的脾细胞miRNA谱会发生变化，肺泡巨噬细胞的miRNA谱也会发生变化。通过给小RNAs测序来比较Ⅰ型株和Ⅱ型株的miRNA表达谱。在三种弓形虫中，miR-17呈现不同的调控模式，如当猪肺泡巨噬细胞被RH株感染后，miR-17的表达下调；而感染Me49株后会表现为上调；被YZ-1株感染后，miR-17在25dpi后上调。而猪肺泡巨噬细胞中调节TNF-α的miRNAs也出现变化，这表明一些新的miRNAs之间可能存在联系。因此，我们可以设想这种炎症途径可能因感染而改变，因为感染过程越沉默，那么寄生虫的入侵便越成功，因为TNF-α信号能导致炎症反应，从而摧毁所有寄生虫。在猪脾脏慢性感染中（50dpi），有大量的miRNAs下调。
小鼠是弓形虫病等多种传染性疾病的主要研究模型。因此，了解这些动物如何响应感染仍然很有意义。例如，Canella等人利用不同种的弓形虫感染的HFF细胞和小鼠（体内），发现具有不同的毒力结果。他们发现miR-146a在感染Me49的HFF细胞中上调，而在感染RH株时下调；ROP16的表达与miRNA的上调密切相关；此外，他们还发现敲除miR-146a基因使动物能免疫一种强毒的弓形虫，而ROP16基因的缺失则使miR-146a的表达以一种特有的方式增加，这便进一步表明弓形虫的蛋白表达与宿主miRNA表达谱之间存在平衡。弓形虫RH和Me49株感染BALB/c小鼠后，宿主血浆中的miR-712-3p、miR-511-5p和miR-217-5p以特定方式上调，但在被伯氏疟原虫（P.beghei）、约氏疟原虫（P.yoelii）、P . chabaudi、微细隐孢球虫（Cryptosporidium parvum）、小鼠肝炎病毒（MHV，mouse hepatitis virus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的小鼠样本中并没有发现这些miRNAs。因此，Jia等人建议即使在感染的早期，也可以用循环miRNA作为检测弓形虫感染的生物标记。
被感染的小鼠大脑也被用来比较研究急性和慢性感染期间弓形虫PRU株在卵囊阶段的全基因组miRNA的变化。当然被弓形虫RH株感染的小鼠脾脏也可以用来比较急性期和慢性期的差别。此外，可以用RH-2F、PRU或CTG感染人神经上皮细胞株比较这些菌株如何改变神经元细胞miRNA表达谱以及神经元的正常功能，miR-132（负责调节多巴胺代谢相关基因的表达）在所有感染研究菌株中均表现为上调。2017年，一项基于北美的队列研究显示，弓形虫感染以癫痫、神经退化和癌症等多种途径影响人脑，该研究还揭示了先天性感染患者脑内蛋白质组和miRNA组表达谱与某些弓形虫（Ⅰ型的RH和GT1；Ⅱ型的Me49和PRU；以及Ⅲ型的VEG）之间的复杂的相互作用，此外，作者还根据这些患者家庭中与感染易感性和抵抗力相关的多态性，观察到NF-κB和TGFβ是所有相互作用分子网络的中心节点，且在这些家庭中存在等位基因变异。
猫miRNA表达谱的变化也是一个研究对象，因为猫是弓形虫的终宿主。感染弓形虫PRU株（II型）的猫肝脏全基因组miRNA表达谱显示，82个调控miRNA中48个下调，而miR-17似乎表现为上调，这表明miRNA簇的表达与弓形虫II型菌株的感染密切相关。
3.4 疟原虫（Plasmodium）与宿主间的相互作用
疟疾是一种由疟原虫（Plasmodium spp.）引起的传染病，主要分布于撒哈拉以南的非洲、亚洲和拉丁美洲，每年造成100多万人死亡（5岁以下儿童最易感染），目前仍是热带国家最具破坏性的疾病。疟原虫的生命周期包括通过被感染的雌性按蚊（Anopheles mosquitoes）叮咬而感染人类，并以子孢子的形式迁移到肝脏中感染肝细胞，被感染的肝细胞破裂从而引发红细胞内的无性循环。肝脾肿大是疟疾的一个特征，疟原虫在无性阶段会出现这一病理改变，从而破坏保护性免疫，而脾细胞和肝枯否细胞能够清除或消除衰老和感染的红细胞（iRBCs）。脾脏巨噬细胞是血液阶段清除疟原虫的主要免疫细胞，一直是许多保护性免疫研究的重点，但目前这些细胞群的miRNA谱并未被研究出来，不过miRNA在血浆、肝脏和脑组织中的表达已经得到了充分研究。
一些研究表明引起人类患疟疾的恶性疟原虫（P . falciparum）和间日疟原虫（P.vivax）的感染能引发miRNA谱的变化。在实验性疟疾模型中能引起小鼠患脑疟疾的自愈性P.chaubadi和P.beghei ANKA株能改变获得性抗疟原虫免疫保护的发展。氯喹疗法（Chloroquine therapy）则是一种常用的疟疾治疗方法，不仅能改变miRNA谱，同时能降低NOD样受体（NLR）家族吡喃结构域1和3（NLRP1和NLRP3）与炎症信号传导相关基因的表达水平。
间日疟原虫感染的患者血浆样本中miR-451和miR-16下调。然而，miR-146a rs2910164多态性可能影响成熟miR-146a的表达水平，从而增加初孕女性对恶性疟原虫的易感性。miR-146a参与TNF受体相关因子6（TRAF6）和IL-1受体相关激酶1（IRAK1）等TLR信号分子的调节（图5）。
图5 疟原虫在病原-宿主相互作用过程中诱导miRNA谱的改变。疟疾的感染开始于携带病原的雌性按蚊（无脊椎动物宿主）的叮咬，随后孢子虫（sporozoite）便进入到肝脏中并分化为裂殖子，裂殖子离开肝脏后将进行血液阶段的无性繁殖，在这一阶段中，疟原虫将分化为配子体（gametocytes），并被蚊子吸收后进入生命周期中的有性阶段，蚊子便可以继续感染下一个人。恶性疟原虫间日疟原虫只感染人类，且两者均能引起人血浆样本miRNA谱的改变。而鼠疟原虫P.chaubadi和伯氏疟原虫（P.beghei）主要感染小鼠，现已作为疟疾实验的模型，它们的感染同样能改变小鼠循环miRNA谱，这种现象在被P.chaubadi感染的小鼠肝脏以及被P.beghei ANKA株感染的小鼠脑中均存在。此外，感染疟原虫后的无脊椎动物宿主的miRNA图谱也会发生改变。图中红色方框中列举了模型中上调的miRNAs；↑表示miRNA的上调，↓表示下调。
夏氏疟原虫（P . chabaudi）感染的小鼠与恶行疟原虫具有一些共同特征，目前作为一种试验模型帮助我们了解疟疾感染的发病机制和所引发免疫应答，以及与T细胞、B细胞活化和促炎细胞因子（如TNF-α和IFN-γ）的产生相关的免疫保护。夏氏疟原虫感染后肝脏中与免疫应答的诱导有关miR-26b、MCMV-miR-M23-1-5p和miR-1274a将会上调，最终表现为IL-1β、TNF-α和IFN-γ以及NF-κB等促炎细胞因子表达。伯氏疟原虫（P.beghei）感染会引发miR-21、miR-122和miR-155的去调控，同时肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞）中miR-155的异位上调会激活IFNγ和TNF相关途径。夏氏疟原虫的感染可促进小鼠急性感染阶段肝脏中miR-188-5p、miR1187、miR-1196-5p、miR-211-3p、miR-32-3p、miR-3082-5p、miR-3960、miR-466i-5p、miR-468-3p、miR-574-5p、miR-669n、miR-709、miR-5126和miR-6538上调，表现为IFN信号激活，从而引发炎症以及细胞程序性死亡。而疫苗则可以阻止let-7、miR-122-5p、miR-142-3p、miR-148-3p、miR-26a-5p、miR-27a-5p、miR-29b-3p、miR-2861、miR30a/c-5p、miR-3968和miR-5097表达水平的下降，促进肝脏再生。
相比于约氏疟原虫（P.yoelii），伯氏疟原虫ANKA型感染引发脑型疟疾（Cerebral Malaria）的小鼠体内miR-27a、miR-142和miR-223的水平增加，这些miRNAs与脑疟疾患者脑微血管中的TNF信号和单核细胞隔离有关。此外，let-7i、miR-27a、miR-150、miR-126、miR-210和miR-155的上调是脑疟疾的发病特征，与免疫调节信号、细胞凋亡和白细胞粘附有关。
恶性疟原虫中的某些ncRNAs在原虫生命周期的不同阶段表达不同，这一现象与毒力相关基因（如var家族）的表达调控有关。研究表明，在无脊椎动物宿主中miRNAs是按蚊抗疟原虫感染过程中的重要调节因子。被伯氏疟原虫感染的冈比亚按蚊（A.gambiae）的中肠中表现为aga-miR-989上调，aga-miR-34、aga-miR-1175和aga-miR-1174下调；此外，Drosha、Dicer I和Argo1的减少使得伯氏原虫能够存活。事实上，用糖喂养的斯氏按蚊（A.stephensi）上调的miRNAs有ast-miR-263a、ast-miR-283和ast-miR-210；而用被感染的哺乳动物喂养的斯氏按蚊表达水平改变的miRNAs有：ast-miR-2944a-5p、ast-miR-92b、ast-miR-989、ast-miR-275、ast-miR-281-3p、ast-miR-281-5p、ast-miR-306、ast-miR-263a-5p、ast-miR-7、ast-miR-309和ast-miR-305-3p。
目前miRNAs已用于许多疾病的治疗以及作为一些疾病的生物标记物。但为什么不能把其用于诊断和正确治疗寄生虫病呢？寄生虫病不仅会损害人类的身体健康，同时也能感染与人类息息相关的家畜和宠物，给人们带来经济损失以及心理上的伤害。然而，包括寄生虫病在内的“被忽视疾病”在治疗方案的制定上仍然存在巨大漏洞。因此本文阐述了miRNAs与脊椎动物和无脊椎动物宿主寄生虫病的关系。
尽管现在miRNA的相关研究越来越多，但miRNA的翻译仍是一个挑战。此外，最近Hanna等人就“miRNAs在临床研究中的作用”进行了综述，并表明目前关于miRNA研究的发现仅限于学术界，通常无法通过临床试验的第3或第4阶段，基础科学和临床应用之间仍存在差距。
关于“被忽视疾病”，研究人员几十年来一直致力于新药以及跟踪识别疾病进程的新生物标志物的开发，此外，与癌症、心脏病、循环系统疾病以及神经系统疾病等热点疾病相比，miRNAs作为生物标记物的应用及其治疗潜力的研究还很薄弱。目前关于寄生虫病的临床试验只有两个，而且还都是队列研究：第一项试验是在美国芝加哥研究的，与弓形虫病患者的蛋白表达相关的miRNA谱；另一项研究则着重于找出巴西萨尔瓦多市锥虫病引起的急性心肌炎患者血浆样本中的miRNAs修饰，该研究可在临床试验数据库中查阅（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01842880?term=miRNA&cond=Trypanosomiasis&draw=2&rank=1）。
因此，miRNAs调控的复杂过程有利于生物标记物和病理学治疗药物的研究。丰富的细胞培养平台、动物模型和循环液（唾液、血浆和血清）也可以用于评估miRNA候选物的毒性、潜在治疗效果以及体外治疗机制。此外，miRNAs可以与传统治疗相结合，靶向大量基因和途径，从而检测宿主对疾病的易感性并改善预后。当然，特异性miRNAs或某些miRNAs组合对宿主免疫反应调节的影响的研究仍是一个重大挑战。
结论
MicroRNAs作为一种小的非编码RNA，不仅是基因表达的转录后调节因子，也是病原体与宿主相互作用的生物调节因子，在宿主与病原体之间复杂的相互作用中发挥着重要作用，既可以作为宿主免疫反应的一部分中和感染，也可以作为病原体为自身利益而影响宿主途径的分子策略。此外，microRNA作为传染性疾病的非入侵性诊断标志物和治疗靶点也将是miRNA应用的一个新思路。
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