编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。
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导读
氮是植物生长和基本代谢过程所必需的营养物质。根系在植物从土壤中获得养分的能力中起着重要作用，与地上植物的生长发育密切相关。根系形态分析表明，低氮条件下诱导根系生长，高氮条件下抑制根系生长。为了更好地了解水稻根系对氮素有效性响应的分子机制和代谢基础，本研究以NH4NO3作为氮源，对低氮（13.33 ppm）、对照（40ppm）和高氮（120 ppm）3种环境条件下水稻根系转录组和代谢组进行了综合分析，试验周期共30 d。在低氮和高氮条件下，分别鉴定出262和262个差异水平的代谢物。在低氮和高氮条件下，分别鉴定了696个和808个差异表达基因。对于差异表达的基因和代谢产物，KEGG通径分析表明，氮素有效性显著影响氨基酸代谢、碳氮代谢、苯丙烷代谢和植物激素信号转导。此外，在高氮和低氮胁迫下的水稻叶片中发现了65个转录因子(TF)，涉及22个TF家族。这些结果还表明，低氮和高氮条件下水稻根系转录调控机制存在显著差异。综上所述，本研究为进一步了解水稻根系对低氮和高氮条件的响应提供了新的信息。原名：An Integrated Analysis of the RiceTranscriptome and Metabolome Reveals Root Growth Regulation Mechanisms inResponse to Nitrogen Availability
译名：对水稻转录组和代谢组的综合分析揭示其根系对氮素有效性的调控机制
期刊：Internationaljournal of molecular sciences
IF：4.183
发表时间：2019年11月
通讯作者：张文忠，高继平
通讯作者单位：沈阳农业大学水稻研究所（Rice Research Institute of Shenyang Agricultural University）
DOI号：10.3390/ijms20235893
如图1所示，与对照组氮素相比，低氮条件抑制地上部生物量积累，而高氮条件下促进地上部生物量积累；低氮条件下促进了根生物量积累，高氮条件下抑制了根生物量积累。与对照氮素相比，缺氮对根冠比有负面影响，而高氮增加了根冠比。与对照组相比，高氮处理显著抑制根长，低氮处理显著促进根长。地上部和根系含氮量随供氮水平的增加而增加；低氮降低了不定根数和根系氧化活性，而高氮对不定根数和根系氧化活性影响不显著。基于LC-ESI-MS/MS进行了非靶标代谢分析，探究了代谢变化对氮素有效性的响应。如图2a所示，与对照氮相比，共有351种代谢物在低氮和高氮条件下具有不同的水平。这其中，262种代谢物在低氮条件下发生变化，其中205种代谢物含量降低，57种代谢物含量升高。在高氮条件下，共有262种代谢物发生变化，其中78种代谢物含量降低，184种代谢物含量升高。在低氮条件下，代谢物含量的增加高于代谢物含量的降低，而在高氮条件下，则表现出相反的结果。根系构型分析表明，低氮促进根系生长，高氮抑制根系生长。这些结果表明，根系代谢产物水平的变化与根系生长密切相关。KEGG代谢途径富集分析将在低氮和高氮条件下确定的差异代谢物分类鉴定为代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程(图2b)。在代谢方面，丰富的途径是氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢。在遗传信息处理中，富集的途径是翻译和折叠、排序和降解。在环境信息处理中，丰富的途径是膜转运和信号转导。在细胞过程中，富集的途径是运输和分解代谢。这些结果表明，氮素有效性显著影响水稻根系的代谢进程。图2 在低氮和高氮条件下对水稻根系代谢特征分析。a代表在不同的氮处理下，具有不同水平、上调和下调的代谢产物的总数；b代表基于KEGG途径分析了这些变化的代谢途径。KEGG、HMDB和Metlin综合数据库的注释分析显示，氨基酸、含氮化合物、碳水化合物、核酸、有机酸、脂肪酸和次生代谢物在不同的氮有效性水平下存在显著差异(图3)。此外，还测定了17种氨基酸，除L-色氨酸、D-色氨酸和赖氨酸外，其余氨基酸均在高氮条件下增加，在低氮条件下减少。L-色氨酸和D-色氨酸在低氮条件下增加，在高氮条件下降低。与对照组相比，大多数含氮化合物在高氮条件下增加，在低氮条件下减少；但包括allantoin、trigonelline、betaine、脯氨酸和O-磷酸-L-丝氨酸在内的化合物在低氮条件下增加。在高氮条件下，核酸和次生代谢物中大多数差异变化的代谢物水平升高，而在低氮条件下，部分碳水化合物水平升高。图3 低氮和高氮条件下不同变化代谢产物的热图。N1、N2和N3分别表示低氮、对照氮和高氮的代谢物水平。a代表氨基酸代谢；b代表N-compound；c代表碳水化合物代谢；d代表核苷酸代谢；e代表有机酸代谢；f代表次级代谢；g代表脂质代谢。利用edgeR软件对低氮和高氮条件下的差异表达基因进行分析（图4）。基于FDR和log2FC筛选DEG，其阈值设定为FDR<0.05和|log2FC|>1。与对照相比，在低氮条件下共有696个基因表现出差异性表达，其中包括355个上调基因以及341个下调基因。在高氮条件下，共有808个差异表达基因，其中包括384个上调基因以及424个下调基因。基于|log2FC|筛选出了丰度最多的30个DEG；在这其中，有9个DEG对高氮和低氮条件都表现出调节反应。基于参考基因(Ensembl Release 38 IRGSP-1.0)的功能注释，有两个候选基因(OsCYSK和OsNEP1)参与氨基酸代谢和能量代谢。同时，有7个候选基因虽然没有被注释到，但对氮素有效性有强烈的响应，因此认为它们在水稻根系对氮素有效性变化的响应中具有特殊的重要性。研究者随机选择的27个基因，基于qRT-PCR扩增，发现qRT-PCR扩增结果与RNA-Seq分析结果相似（Pearson系数为0.91），证实了RNA-Seq数据的可靠性。图4 低氮和高氮条件下水稻根系转录分析。a代表低氮条件下DEGs的数量；b代表低氮条件下丰度前30的DEGs；c代表高氮条件下DEGs的数量；d代表低氮条件下丰度前30的DEGs。基于GO和KEGG富集分析，进一步分析了DEGs的功能及其参与的相关生物学过程。通过GO分析，将低氮和高氮条件下的DEGs分为细胞组成、分子功能和生物过程，涉及28个GO条目。在细胞成分中，丰富的GO条目包括细胞、细胞部分和细胞器。在分子功能方面，富集的GO条目包括催化活性、结合活性和转运蛋白活性。在生物过程中，富集的GO项有代谢过程、细胞过程和单个生物过程。利用KEGG对本研究中确定的DEGs进行路径富集分析发现，与整个基因组背景相比，碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、次生代谢产物的生物合成、信号转导和脂肪代谢等条目在这些基因中显著富集。在低氮和高氮条件下，大多数氨基酸代谢相关基因的表达均降低。大多数碳水化合物代谢相关基因在低氮条件下表达降低，在高氮条件下表达增加。同时，在低氮条件下，与“能量代谢”相关的基因表达受到抑制。转录因子可以调节其他基因的表达，在调节植物生长、适应生物和非生物逆境中发挥重要作用。如表1所示，在高氮和低氮条件下的水稻叶片中共鉴定出65个TFs，覆盖22个TF家族。与对照相比，48个TFs在低氮条件下差异表达，其中包括35个上调和13个下调TFs。在高氮条件下，有23个TFs表现出差异表达，其中包括10个上调和13个下调TFs。总体而言，大多数TFs在低氮条件下上调，在高氮条件下不变或下调。bHLH、NAC、MYB相关家族、WRKY家族以及ERF家族都是相对较大的TF家族，对氮素有效性具有响应。虽然MYB相关家族和NAC家族成员对不同的氮素有效性水平表现出不同的响应，但在低氮条件下检测到4个MYB相关家族成员（3个上调），而在高氮条件下检测到的6个表达下调的MYB相关家族TFs。在低氮条件下检测到6个NAC转录因子，其中包括5个上调的转录因子，而在高氮条件下检测到的3个NAC家族转录因子表达下调。C2H2和WRKY家族成员在低氮条件下特异性上调。对转录组和代谢组之间的KEGG途径富集进行了整合分析。在高氮条件下，包括苯丙氨酸代谢、异喹啉生物碱生物合成和氮代谢在内的三条途径被富集。相应地，在低氮条件下，包括氮代谢、精氨酸生物合成和氨基酸生物合成在内的三条通路被富集。这些结果表明，氮、氨基酸的代谢，特别是苯丙氨酸代谢，在调控高氮和低氮条件下的根系构型和生理特性方面起着重要的作用。如图5所示，苯丙氨酸和酪氨酸在高氮条件下增加，在低氮条件下降低。在低氮条件下，表达的苯丙烷生物合成基因OsPAL7、Os4CL5、OsCCR1、OsCCR5、OsCCR17、OsCCR18、OsC4H、OsC4H1、OsPHT2、OsHCT4、OsCYP84A以及OsBGLU16的丰度在低氮条件下增加，除OsCCR1外，其余基因在高氮条件下均受到抑制。在低氮和高氮条件下，肉桂醇脱氢酶基因产物OsCAD6的丰度均增加。在高氮条件下，OsCAD8A和OsCAD8D的表达增加，但在低氮条件下表达不变。在低氮和高氮条件下，共有8种参与类苯丙烷生物合成的过氧化物酶被鉴定为DEGs。所有基因在高氮条件下均上调，其中4个基因在低氮条件下下调。图5 低氮和高氮条件下富含苯丙酸生物合成途径的代谢产物和转录物。6 氮素有效性影响与生长和应激反应相关的植物激素水平植物激素在植物生长、适应生物和非生物胁迫以及感知环境条件变化，特别是养分有效性方面发挥着重要作用。DEGs的KEGG富集分析结果表明，在低氮和高氮条件下，植物激素信号转导代谢途径显著富集。因此，分析了在低氮和高氮处理下水稻根系中IAA、ABA、CTK、JA、SA和ACC浓度的变化(图6)。与对照相比，低氮条件下IAA和CTK含量变化不显著，而ABA、JA、SA和ACC含量增加。在高氮条件下，IAA、CTK和SA升高，ABA和JA降低，ACC变化不显著。图6 低氮、对照和高氮条件下水稻根系中IAA、ABA、CTK、JA、SA和ACC的浓度。根系在连接植物与土壤，从而连接土壤与大气方面起着重要作用。在本研究中，缺氮诱导根生物量和根长，并抑制外生根的数量，而过量的氮则抑制根生物量和根长。ROA作为反映根系生理活性的重要指标，有研究结果发现，低氮显著抑制ROA，这说明在低氮和高氮条件下，水稻根系构型和生理发生了明显的变化。然而，氮素有效性的适应机制并不完全相同。基于转录组和代谢组的整合分析，研究者进一步阐明了氮素调控根系生长发育的遗传和代谢基础。KEGG途径分析表明，氮素供应显著影响氨基酸代谢、碳氮代谢、苯丙烷类代谢和植物激素信号转导。与之前对地上植物对低氮和高氮的反应的研究相比，研究者发现植物激素的信号转导在水稻根中受到了显著的影响，这可能与根系在低氮和高氮条件下与外界环境直接接触有关。无机氮由特定的转运蛋白吸收和转运，如铵转运蛋白(AMTS)和硝酸盐转运蛋白(NRTs)。发现OsNRT2.4在低氮条件下上调，在高氮条件下下调。此外，在本研究中，与氮同化相关的DEGS在低氮条件下显著下调，而在高氮条件下差异不显著。有趣的是，水稻根系氨基酸随着氮素水平的增加而增加，而碳水化合物的变化与氨基酸的变化不一致(图3)。表型分析还表明，水稻根冠比随着施氮量的增加而降低(图1)。这些结果表明，在低氮条件下，水稻根系的补偿生长是通过协调碳氮代谢来维持正常生长的。苯丙烷代谢途径与木质素的合成密切相关。木质素是植物骨架的主要组成部分，在植物根系的生长过程中起着重要的作用。OsCCR1的表达位点集中在木质化程度较高的区域，直接参与木质素的合成。本研究中发现大多数与苯丙烷生物合成相关的基因在低氮条件下上调，在高氮条件下下调(图5)。有趣的是，在低氮条件下，参与类苯丙烷生物合成的过氧化物酶编码基因的表达水平降低，而在高氮条件下其表达水平上升(图5)。EGase在植物伸展区域有高表达，但在伸展停止的区域不表达或下调，表明EGase在植物细胞的伸长过程中起着重要作用，并可能直接参与组织中纤维素的生物合成。在本研究中，EGase编码基因(OsBGLU16)在低氮条件下显著上调(图5)。这些结果表明，苯丙烷类代谢途径的差异是造成低氮和高氮根系形态差异的主要因素。植物经历了一系列的生理、分子和发育变化，以响应环境中的氮素供应。先前的研究利用RNA-Seq技术，检测到85个在响应氮胁迫和调节植物生长方面发挥重要作用的转录因子。本研究中，包括bHLH，NAC，MYB，WRKY以及ERF在内的TF家族对氮素有效性具有响应，其中WRKY家族的成员在低氮条件下显著上调(表1)。此外还发现，大多数TFs在低氮条件下上调，而在高氮条件下没有变化或下调。这些结果表明，低氮和高氮条件下水稻根系转录调控机制存在显著差异。在未来的研究中，确定氮响应转录因子在增加水稻产量和减少化肥过度使用方面的作用是十分重要的。本研究中的结果提供了一个结构变化的整体视图，以及氮素调节根系生长发育的潜在遗传和代谢基础。苯丙烷类生物合成相关基因表达的变化改变了水稻的根构型，以响应氮素的有效性。植物激素和转录因子在适应低氮和高氮条件以及调节根系构型变化方面起着重要作用。
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