综述 | 英国伯明翰大学：滑膜组织转录组分析的新进展
编译：风道恋海，编辑：十九、江舜尧。
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转录组学技术正在在不断发展和改善，以至于人们对健康和疾病中基因表达的理解不断加深。这些技术已被用于研究类风湿关节炎患者关节的病理变化，从而发现疾病机制和新的潜在治疗靶点。微阵列最初用于整个组织和细胞亚群的研究问题，而大量的RNA测序可以进一步阐述这些发现。一个关键的例子是通过RNA测序对类风湿关节炎的病理类型进行分类，此前这类研究主要通过微阵列和组织学进行。单细胞测序在理解细胞亚群（特别是滑膜成纤维细胞的多样性和功能方面）已经有了一个阶段性的改变。未来技术的发展，如高分辨率的空间转录组学将有效地整合单细胞转录组学和地理空间数据，提供对滑膜病理学的综合理解。研究类风湿关节炎（RA）中滑膜病变的转录组变化，有助于人们更好地理解疾病的发病机制。本文详细介绍了滑膜中基因表达的研究途径，包括滑膜细胞的分离方法、组织和细胞的基因芯片分析以及RNA测序技术。作者将介绍基因表达技术的进展，这些技术提高了我们对疾病过程的理解，重点是了解成纤维细胞群体，新的转录组技术对成纤维细胞群体产生了最深远的影响。
论文ID
原名：New Developments in Transcriptomic Analysis of Synovial Tissue
译名：滑膜组织转录组分析的新进展
期刊：Frontiers in Medicine
IF：3.113
发表时间：2020.01
通讯作者：Andrew Filer
通讯作者单位：伯明翰大学-炎症与衰老研究所（英国）
DOI号：10.3389/fmed.2020.00021
综述内容
背景介绍
研究进展
1 从滑膜组织中分离细胞
相关研究通常从整个组织或单个细胞群进行。研究滑膜基因表达最初采用全组织方法来评估广泛的器官水平变化。虽然这项工作为了筛选生物标记物和研究滑膜和全身炎症之间的联系，但很难确定哪些特定细胞负责基因表达的调。此外，小细胞群体中的细微而相关基因表达的改变可能被其他基因的改变所掩盖，这意味着可能遗漏重要的机制。
虽然获得整个滑膜组织样本的方法相当标准化（关节成形术或活检），但获得细胞群的方法是多种多样的，这与下游分析的结果相混淆。酶消化法和外植体生长法是分离和研究滑膜细胞，特别是滑膜成纤维细胞的两种主要方法。酶消化法主要是破坏细胞外基质，并形成滑膜细胞悬浮液。然而不同条件的分离技术，使得细胞的活性和标记物表达和细胞活力的影响，这在相关研究组之间的研究结果的比较充满挑战性。有关外植体生长技术的实验步骤可能比较简洁，相关资料之间的描述相对一致。将滑膜组织的小片段放入组织培养中，使粘附细胞从组织中迁移并开始增殖。7天后，取出剩余组织并培养迁移增殖的细胞。但外植体生长技术选择迁移并快速增殖的细胞，意味着其他种群可能不会被考虑在内。
为了解决细胞分离方法的异质性，NIH成立一个由政府、行业和非营利组织资助的研究团体联合体（AMP, https://www.nih.gov/research-training/accelerating-medicines-partnership-amp），从包括滑膜在内的多个组织中分离细胞制定了优化方案，同时还制定了滑膜组织的冷冻保存方案，以便日后消化，这有助于减少批量效应。这些措施为研究滑膜分离领域提供了一致性的条件，使得不同研究组的实验结果之间的比较更加可靠。
2 基因芯片在滑膜的研究的应用
3 RNA-Seq技术
4单细胞分析方法在滑膜组织中的应用
由于样品中细胞数量和类型的限制，高通量RNA-seq可能会使结果产生偏差。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以通过对组织内或细胞子集内的每个细胞进行独立测序来减少这种偏差（图1）。单细胞测序凭借其高度的准确性和特异性成为单细胞研究的理想工具，它能以最小的样本起始量开展无偏差的高通量研究。然而，值得注意的是：首先，有可能对数据进行过度聚类，导致研究人员相信存在比实际存在更多的离散种群。其次，存在多种降维和聚类方法，这可能导致数据存在不同的解释，因此作者应该清楚地说明。第三，scRNA-seq获得的信息深度可以被少量起始RNA所限制，这意味着能够被识别和量化的基因的绝对数量低于高通量RNA-seq。为了利用这项技术的优势，这两种方法通常同时用于识别关键亚群，然后进一步研究基因表达。
图1高通量RNA-seq（A）与单细胞RNA-seq（B）示意图。高通量RNA-seq 要求研究人员预先选择细胞群或对整个样本进行测序，而单细胞RNA-seq不需要预先选择，能够以无偏差的方式识别细胞群。
Mizoguchi等人采用基因芯片、高通量RNA-seq以及单细胞RNA-seq技术的联合方法，鉴定RA和OA患者滑膜组织中成纤维细胞的亚群。流式细胞术分析CD34、CD90、PDPN和CDH11的表达，发现CD45-、CD31-、CD146-细胞分裂成7个亚群。然后根据这些群体的基因芯片和高通量RNA-seq分析数据，确定了的三个细胞群体（CD34-CD90-、CD34-CD90+和CD34+），并且利用scRNA-seq技术证实了这一发现。另外利用流式细胞技术发现CD34-CD90+细胞群能将单核细胞分化为破骨细胞，提示其在骨调节和损伤中的作用。CD34+细胞群表达高水平的IL-6、CXCL12和CCL2，而CD34-CD90-细胞群高表达MMP1、MMP3、PRG4、HAS1和CD55。这些发现表明，前人研究中分离的滑膜内层以及滑膜下层并不能完全反映滑膜成纤维细胞群的异质性。
单细胞测序平台有助于我们了解成纤维细胞亚群的真正异质性，从而了解滑膜病理学。在NIH-AMP联盟内，通过使用高通量RNA-seq以及单细胞RNA-seq简技术、流式细胞技术对大量RA和OA样本进行联合研究，扩大了对滑膜成纤维细胞亚群的探索。Zhang等人除了定义了类风湿关节炎滑膜中的髓样细胞、T细胞和B细胞亚群外，还确定了四个滑膜成纤维细胞群：一个CD55+内层群和三个滑膜下层裙（CD34+、HLAhi或DKK3+）。在基因表达方面，亚系群体之间的相似性大于衬系群体，这一特征反映在亚系群体中细胞外基质相关通路的共同富集。HLAhi滑膜成纤维细胞是IL-6的主要来源，根据组织学鉴定的免疫浸润对类风湿关节炎样本进行分类时，HLAhi人群在富含白细胞的滑膜中扩大，提示该人群可能在滑膜内引发经典炎症，而其他人群（如CD55+衬里层人群）可能与软骨破坏有关。
利用小鼠关节炎模型进一步探讨了单个滑膜成纤维细胞群的功能。Croft等人采用血清转移诱导的关节炎模型，结合成纤维细胞活化蛋白-α（FAPα）缺失的细胞，探讨滑膜成纤维细胞亚群的作用。FAPα在RA滑膜内层和滑膜下层的成纤维细胞上均有表达，为滑膜成纤维细胞的整体缺失提供了依据。关节炎期间缺失FAPα+的细胞会导致炎症的显著减少，伴随着滑膜细胞减少，关节损伤和白细胞浸润。这些细胞群的基因表达谱与FAPα+CD90+细胞高表达的趋化因子和细胞因子（包括IL-6）存在进一步的相似性，而FAPα+CD90-细胞显示更高水平的RANKL和MMPs。通过将分类细胞亚群植入关节炎小鼠关节中证实了这些细胞亚群的功能。FAPα+CD90+细胞增加炎症但不增加关节损伤，而FAPα+CD90+细胞则相反。最后，scRNA-seq分析小鼠滑膜成纤维细胞，共鉴定了5个独立的细胞群，一个滑膜内层细胞群，三个滑膜下层细胞群和一个额外的循环细胞群。
展望
单细胞RNA-seq技术在滑膜成纤维细胞的研究的应用提供了一个很好的例证。以前的认知仅局限于基于滑膜解剖学亚区和有限的成纤维细胞表面标记物的推测。研究人员首次能够利用单细胞测序分析鉴定并推断了单个成纤维细胞亚群的功能。这为理解炎症性关节炎的病理生物学和针对成纤维细胞的新治疗方法提供了令人兴奋的新机会。例如最近在RA组织中通过质谱流式细胞术鉴定了一个新的促炎性滑膜T细胞亚群。此外，通过测序对转录体和表位进行细胞索引（CITE-seq）和RNA表达及蛋白质测序分析（REAP-seq）等技术能够在单个细胞水平上解析转录组和蛋白质组数据。
目前的挑战是，将先前已有的研究结果重新整合到这个新的亚群框架之中。同时采用激光捕获显微切割技术等，将亚细胞组织蛋白质组学（基因组学）及其动态变化等多种参数与分离出的细胞转录组和蛋白质组分析数据结合起来。
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