科研 | 源于植物乳秆菌的碳点——微生物标记成像的利器（国人作品）
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来自东南大学团队的研究，开发了来自源植物乳秆菌的碳点，可对生物膜内包裹的微生物进行成像，具有多种优点。
论文ID
原名：Imaging biofilm-encased microorganisms using carbon dots derived from L. plantarum
译名：使用源于植物乳秆菌的碳点来标记成像包裹于生物膜中的微生物
期刊：Nanoscale
IF：7.233
发表时间：2018年
通信作者：Fengming Lin, Zhan Chen
通信作者单位：State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096, China
实验设计
该实验从植物乳杆菌中合成碳点CDs-605，通过简洁的一步水热碳化法制备，检测该碳点多种包裹于生物膜中的微生物的成像效果，并与已有的荧光探针比较。
实验内容
实验1：制备碳点及其理化性质
将过夜的L. Plantarum LLC-605细胞培养液取出，采用一步水热碳化法制备碳点CDs-605。该碳点平均粒径3.1 nm，带负电荷，含有-OH，-COOH和-CONH-等多种官能团。在365 nm UV照射下，可发出蓝绿荧光。
Fig 1 CDs-605的特性
实验2：标记生物膜的微生物
CDs-605可标记死亡的大肠杆菌，显示绿色荧光，但对健康成活细菌无标记作用，从而实现死菌标记成像。且该标记不需长时间孵育或避光操作。死活菌区分是由于该碳点的负电荷和亲水表面阻碍其标记活菌，但其微小粒径可使其穿过死菌破损的细胞壁。同时，该碳点可配合已有的荧光标记探针共同使用，比如SYTO 9，进而实现死活菌区分标记。而且其具有的不需孵育，不需避光，不需冲洗等优点使其更优于已有的荧光标记探针。进一步发现，CDs-605可标记不同时期的生物膜，分别在生物膜形成24, 48, 96和120h时，加入碳点，都可以明显发光。
Fig 2 不同状态下大肠杆菌与碳点共孵育的共聚焦荧光显微镜照片
Fig 3 碳点与SYTO 9对大肠杆菌生物膜染色后的荧光显微镜照片
Fig 4 在生物膜形成24, 48, 96和120h时，加入碳点染色标记
实验3：碳点对生物膜的作用
为了验证碳点是否影响生物膜结构，5日龄生物膜与不同浓度碳点共孵育不同时间，结果证明在不同浓度与不同孵育时间下，生物膜都未受到影响。因此该碳点可作为一个具有良好生物相容性的标记探针。
Fig 5 碳点对大肠杆菌生物膜的影响
实验4：碳点的光稳定性
在不同pH，温度和缓冲液浓度下，检测碳点的光稳定性。在pH 1和pH 13下，该碳点仍能保持60 %和80 %发光性。而温度，缓冲液浓度以及储存时间对碳点的发光性几乎没有影响。
Fig 6 碳点在不同影响条件下的光稳定性
实验5：碳点的广谱标记性
检测碳点是否对革兰氏阳性以及真菌有作用，结果表明，该碳点可以标记S. oneidensis, P. aeruginosa, S. aures以及真菌T. reesei，证明其广谱标记性，具有更广泛的应用价值。
Fig 7 碳点对不同微生物生物膜的标记作用
评 论
该研究通过植物乳杆菌的一步水热碳化成功地制备了碳点CDs-605。该方法简便，环保且可再生，而植物乳杆菌属于乳酸菌，对人体健康有益。CDs-605可用于标记生物膜包埋的微生物，具有几个优点：首先，标记生物膜包埋的微生物是在没有孵育，没有避光和不洗涤的情况下进行的，非常方便的。其次，生物膜在CDs-605处理24小时后保持完整，表明CDs-605不会干扰生物膜，因此不会影响与生物膜相关的实验结果。第三，CDs-605显示出比商业染料SYTO 9更好的光稳定性。此外，CDs-605嵌入生物膜的成像容易且通用，与荧光蛋白的成像方法相比，荧光蛋白复杂且特定于菌株，严重依赖关于遗传工具的开发，可能会给实验结果带来一些不必要的干扰。这篇论文第一次报道了碳点可以作为染色材料应用于成像生物膜包裹的微生物，是非常有价值的。
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