编译：Frank，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
放线菌以其具有产生多种次生代谢产物的代谢潜力而闻名。放线菌在生物地球化学循环以及土壤发育中也起着重要作用。然而，关于干旱地区土壤中植被类型对放线菌群落结构的影响知之甚少。因此，作者分析了黑河流域五种生态系统的放线菌群落。使用16S rRNA高通量测序，作者发现了11种放线菌，其中主要是放线菌纲（36.2％）、嗜热油菌纲（28.3％）、酸微菌纲（19.4％）。所有样品中均存在5个菌纲、15个菌目、20个菌科和36个菌属。占主导地位的泛化种属是Gaiella、土壤红色杆形菌属、诺卡氏菌属、分枝杆菌属和假诺卡氏菌属。放线菌的群落结构受到环境和植被类型的显着影响。沙漠生态系统中放线菌群落的多样性很高，该生态系统包含未分类序列的比例最高，代表稀有放线菌丰度较高。使用PICRUSt进行的功能性宏基因组学预测表明，放线菌在沙漠和农场生态系统中的氮循环中都起着重要作用。
原名：Variation in Actinobacterial Community Composition and Potential Function in Different Soil Ecosystems Belonging to the Arid Heihe River Basin of Northwest China
译名：西北干旱黑河流域不同土壤生态系统中放线菌群落组成和潜在功能的变化
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.259
发表时间：2019.9
通讯作者：陈拓1；刘光琇2
通讯作者单位：
1.中国科学院西北生态环境与资源研究所，低温地球科学国家重点实验室
2.兰州极端环境微生物资源与工程重点实验室；中国科学院西北生态环境与资源研究所，沙漠与荒漠化重点实验室
DOI: 10.3389/fmicb.2019.02209
1 采样点概述和土壤取样
中国西北地区的黑河流域是该干旱地区内的第二大内陆河流域，上游位于祁连山北坡。降水主要发生在夏季，并且从东向西减少，同时从低海拔约200 mm增加到高海拔600 mm。从低海拔到高海拔的环境类型包括：沙漠草原、干旱灌木草原、森林草原、亚高山灌木草甸、高山寒漠草甸和高山永久冻土-冰雪。黑河流域的下游位于阿拉善高原北部，是中国最干旱的地区之一，降雨集中在夏季，年平均降水量为42 mm，年平均蒸发量为3755 mm。从五种自然土壤环境：森林、灌木丛、草甸、沙漠和农田中收集土壤样品（表1）。对于森林、灌木和草甸生态系统，选择了四种不同的代表性植物物种进行土壤采样。在沙漠中，选择代表四种不同沙漠化程度的土壤。对于农田，选择了用四种不同肥料处理过的土壤样品。
表1.土壤样品位置概述。
2 DNA提取和测序
DNA提取试剂盒：PowerSoil DNA分离试剂盒（MoBio Mo Bio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA）引物：细菌通用引物515F和806R扩增了细菌16SrRNA基因的V4区
3 序列分析
使用QIIME 1.91和Bio-Linux 8.0.5对原始数据质量进行修整，使用QIIME上的usearch v11.0将其余序列聚类为具有至少97％同一性的可操作分类单位（OTU），然后根据序列分类将每个序列分配给RDP。用QIIME从每个文库中鉴定出属于放线菌门的序列。特有种被定义为20个样本中最多在两个样本存在的科或属，而泛化种被定义为在18个以上样本中存在的科或属。登录号为KCVG00000000。
4 元基因组分析
使用PICRUSt基于16S rRNA序列预测放线菌群落功能。为了确定每个生态系统中的OTU，将16S rRNA序列与Greengenes据库中的序列进行了比较。在QIIME中，使用pick_closed_reference_otus.py至少使用97％的同一性对每个OTU进行分类。使用PICRUSt中的normalize_by_copy_number.py根据代表每个OTU的序列数对每个生态系统的数据进行了归一化。随后，参考KEGG，使用Forecast_metagenomes.py脚本来预测给定OTU的元基因组功能，使用metagenomeome.py脚本分析每个样品的基因和所选顺序的贡献。
5 统计分析
样品的α多样性是通过QIIME中的alpha_diversity.py计算的。遵循Bray-Curtis方法，使用QIIME中的beta_diversity.py确定放线菌群落和元基因组基因功能含量的差异。基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度通过R3.1.3中的vegan包用于可视化放线菌群落的组成。使用ANOSIM检测来评估环境的显着变化是否与放线菌组成或环境有关，并使用QIIME中的compare_categories.py脚本预测基因组功能，用compare_categories.py脚本检测每对环境的放线菌群落组成的显着变化。用LEfSe分析对高维生物标志物发现进行了评估，并对放线菌群落和元基因组基因功能含量进行了解释。我们使用网络分析来探索每种环境中放线菌群落的共现模式。
1 黑河流域土壤放线菌的群落组成
20个土壤样点中总共362554个序列，其中总共110773个放线菌序列。当按97％相似性分组时，获得17714个放线菌OTU。12010个OTU仅包含一个序列，最丰富的20个OTU包含22,440个序列，占总数的20.3％。前100个OTU和1,000个OTU分别占整个数据集的32.2％和59.1％。97%的放线菌序列可分为11类（图1），每个类别的平均相对丰度是放线菌纲（36.1％）、嗜热油菌纲（28.1％）、酸微菌纲（19.4％）、MB-A2-108（8.4％）、腈基降解菌纲（2.5％），0319-7L14（2.1％），红杆菌纲（1.2％），红蝽菌纲（0.14％），WCHB1-81（0.02％），FFCH16263（0.006％）和KIST-JJY010（0.005％）。在更低分类中，黑河流域共发现33个菌目、83个菌科、214个菌属和247个菌种。链霉菌属序列仅占总数的不到1％。
图1. 20个样点的放线菌群落组成。
2 放线菌群落的泛化种和特有种
每个放线菌生物分类单元都被分配了相对丰度与占有率，以将分类群分为两大类：土壤泛化种和特有种（图2）。共有5个菌纲、15个菌目、20个菌科和36个菌属的泛化种，以及3个菌纲、7个菌目、17个菌科和69个菌属的特有种。在菌纲分类级别，泛化种是放线菌纲、嗜热油菌纲、酸微菌纲、MB-A2-108和红杆菌纲，而WCHB1-81，FFCH16263和KIST-JJY010是特有种。在菌科分类级别，微球菌科、67-14和土壤红杆菌科是主要的泛化种，而未培养酸微菌目细菌、酸微菌科和酸热菌科是主要的特有种（图2）。在属分类级别，Gaiella、土壤红色杆形菌属、诺卡氏菌属和芽球菌属是主要泛化种，而未培养酸微菌目细菌、柯林斯菌属和未培养的原核生物Gaiellales是主要的特有种。泛化种属的数目比非泛化种属要高得多，超过一半的特有种属归类于放线菌属。
图2. 菌科级别分类上放线菌群落的丰度和占有率图（A），占有率表示一个菌科样点数量，特有种（蓝色），泛化种（红色）。前17个栖息地特有种（B）和前20个泛化种（C）的平均相对丰度直方图，所有的相对丰度是放线菌的比例。
3 不同植被生态系统之间放线菌群落的差异
根据来自SILVA数据库的分类学信息，可以将序列分为未分类、未培养和准确分类。在五个生态系统中随着分类水平的降低，序列之间出现更多差异，未分类和未培养序列的比例增加，其中草甸未培养和准确分类的序列所占的比例最高。放线菌群落的丰富性和多样性都遵循相同的趋势（图3），最高的是农田生态系统，其次是沙漠、森林、灌木和草甸生态系统。属于草甸生态系统的样品多样性比其他生态系统具有更大的变化范围，这很可能反映了群落结构与植物物种之间的联系。从农田和森林生态系统中获得的样品多样性比其他生态系统小。用NMDS双谱图鉴定了来自20个样点放线菌群落的差异（图4）。除M4之外，所有样点都与它们的环境聚合在一起。值得注意的是，放线菌群落的组成受到环境的显着影响，五种生态系统对放线菌群落的影响不同。农田环境中四个样本的相似度最大为0.82±0.03。相比之下，来自草地的四个样本之间的差异最大为0.45±0.18。比较每对环境之间放线菌群落的相似性，发现灌木林和森林生态系统最相似（0.67±0.09），而灌木林与农田或沙漠生态系统相比则表现出最大的差异性（0.36±0.03和0.36± 0.05）。在菌纲分类学级别上，放线菌纲在森林、沙漠和农场环境中占主导地位。嗜热油菌纲是灌木和草甸环境中最大的类群（图1）。在菌科层面，生态系统之间的差异更大。使用LefSe分析，我们获得了每种环境从菌纲到物种的放线菌生物标记，在森林样品中鉴定出29种生物标记，在灌木林样品中鉴定出22种生物标记，在草地样品中鉴定出2种，在沙漠样品中鉴定出45种，在农田样品中鉴定出41种。
图3. 五种生态类型中放线菌群落的香农-维纳指数（A）和Chao1指数（B）的箱线图。
图4. Bray-Curtis差异矩阵的NMDS双标图，20个样点的放线菌群落结构（A）和宏基因组学功能分析（B）。
4 放线菌群落潜在功能的差异
不同生境放线菌的功能预测途径是相似的，五个最常见的代谢预测途径是嘌呤代谢、丁酸酯代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解、丙酸酯代谢和脂肪酸代谢。但是，最丰富的两个特定功能是转运蛋白和ABC转运蛋白，它们属于环境信息处理类别，占所有基因的约11％。用NMDS双标图鉴定了20个样点中放线菌群落的潜在功能的差异（图4）。与放线菌群落的不同一致，除M4外所有样点都与其环境聚集在一起。放线菌群落的潜在代谢功能受到环境的显着影响。作者强调，不同的放线菌群落具有与其所占据的生态系统相关的不同代谢功能。此外，LefSe分析还表明每种环境下潜在代谢功能显着差异，灌木丛样品鉴定出20种生物标记，草甸15种生物标记，农田9种生物标记，沙漠16种生物标记和森林3种生物标记。显然，氮代谢是放线菌群落的重要特征，尤其是在农田和沙漠生态系统中（图5）。在沙漠环境中丰富的鱼孢菌科是固氮途径（模块 M00175）的主要物种。S4和M4样品中存在的弗兰克氏菌科也具有固氮能力。在沙漠和农田生态系统中，异化硝酸盐还原和反硝化途径（分别为模块M00530 and M00529）也很丰富。
图5. 菌目的估计基因计数贡献堆叠柱形图，M00175（A，固氮）、M00530（B，异化硝酸盐还原）和M00529（C，反硝化）。
黑河流域五个不同生态系统中放线菌群落的详细描述表明，群落结构根据土壤的主要植被类型和营养状况而变化。贫营养的沙漠土壤中的多样性群落结构令人惊讶，放线菌可以在沙漠土壤固氮中发挥重要作用。该栖息地还因其稀有放线菌丰度高而引人注目，这些放线菌可能是新生物活性化合物的来源。
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