科研 | 细菌自身的功能性状决定了根际是否与其进行组合
本文由木木的天空编译，董小橙、江舜尧编辑。
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导 读
文章使用16S核糖体RNA扩增子测序来确定细菌群落的分类学结构，并用猎枪宏基因组学方法来研究群落潜在的功能多样性。在研究中，发现土壤对不同稀释接种物培养后的细菌群落组合有很强的选择性影响，而且这些在土壤中运行的强选择过程导致不同接种物再生后形成的菌群具有一定的均质性。特别是，植物将在分类和功能性状水平上发挥进一步的选择作用。最为有趣的一个问题是根际的选择过程是否对细菌功能性状产生强烈的影响，如果是的话，那么这种选择是否在具有这些性状的物种之间是随机的，还是物种特异性的。研究结果表明，根际微生物群富集的过程中重点选择了与转运体、EMP通路和氢代谢相关的特定功能基因的微生物。这种选择在具有这些功能性状的细菌中不是随机的，而是具有物种特异性的。总的来说，这表明细菌的功能性状是根际在组装微生物群落时是否择他们的关键因素所在，且最为重要的是，根际是选择对自己有利的功能基因而不是与微生物群为敌。
论文ID
原名：Functional traitsdominate the diversity-related selection of bacterial communities in therhizosphere
译名：细菌自身的功能性状决定了根际是否与其进行组合
期刊：The ISME Journal
IF：9.520
发表时间：2017
通信作者：JA van Veen
通信作者单位：Department ofMicrobial Ecology, Netherlands Institute of Ecology NIOO-KNAW
试验目的
本研究的主要目的在于更深入的了解细菌功能的多样性在土壤和根际的分类学和功能水平上的选择中所起的作用。
为了获得不同多样性的细菌群落，需要将悬浮液的连续稀释液接种到原始灭菌的大块土壤中。在一定时间的培养后，将植物盆栽在不同的土壤样品中。通过比较土壤和根际土壤细菌群落的组成和功能性状的差异，可以了解多样性在根际选择过程中的作用；通过分类学和功能性状的比较，可以得出根际选择是否基于分类学和/或功能的结论，进而可以研究细菌群落的多样性对根际细菌群落选择的影响。
研究亮点
研究结论是基于某些特定功能基因在根际的相对丰度高于在土壤中所发现的，这表明根际是尽量选择这些对自己有利的微生物功能基因而不是与他们为敌。尽管根际功能选择对植物适应性功能的选择机制和结果尚不清楚，但目前的研究结果为更好地理解土壤和根际微生物群落高度复杂的组合过程提供了有价值的信息。
图1 根系分泌物将土壤养分与植物养分策略联系起来
引 言
生物多样性的丧失会对生态系统过程产生重大影响，例如生态系统的生产力和稳定性等。然而，这种效应是否适用于被认为具有高度功能冗余的微生物群落仍然是一个争论较大的问题。土壤微生物代表了陆地生态系统中的大部分生物多样性，并且主要负责维持土壤质量和功能。更深入地了解土壤微生物多样性及其与功能的联系，可以更好地了解生物多样性对陆地生态系统功能的重要性。
根际是土壤活动和多样性最突出的热点之一。微生物群落的组成及其在根际的活动对植物的生长和健康有很大的影响。根际微生物群落主要来源于周围土壤群落。因此，土壤群落的变化，例如人为扰动引起的变化，预计将对根际微生物群落的聚集和最终组成产生重大影响。
图2 根系结构图
尽管越来越多的文献研究了包括土壤和植物特征在内的随机和确定性因素对不同分类水平微生物群落组合的影响，但土壤和植物特征对不同功能水平微生物群落组合过程的相对贡献依旧是不清楚的。实验评估的困难在于理解微生物群多样性是如何被土壤和植物等因素创造和影响的。目前微生物多样性研究的一个主要瓶颈是缺乏可靠的方法来对多样性进行定向和可预测的改变，从而解决群落聚集的潜在机制。通常用于评估多样性影响的方法是所谓的稀释的方法，即，通过接种稀释的悬浮液可以改变土壤中微生物群落的多样性。
在以前的大量研究中，一直忽略了微生物群落的功能特性是否在土壤和根际微生物种类的选择中发挥作用的问题，而如果的确发挥啦作用那么又是如何发挥作用的。通过比较土壤和根际群落的差异，我们可以了解多样性在根际选择过程中的作用;通过分类学和功能性状的比较，我们可以得出根际选择是否基于分类学和/或功能的结论。因此，结合近年来高通量测序的进展，现在我们有能力评估根际微生物组的分类组成和功能，稀释的方法可能有助于我们解决该问题。
试验设计方案
在15厘米深的土壤中采集了30升的块状土壤。土壤经过筛分（5 mm筛孔）并均质化，然后储存在500克等的塑料袋中。将一袋土分开存放，准备接种。通过γ-辐射（>25kGray，Isotron，Ede，荷兰）对土壤进行灭菌。从接种袋中取0.5 g土，接种到胰蛋白酶、大豆琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，进行无菌性试验。在培养6天的琼脂平板上未观察到六次重复土壤的细菌和真菌生长。新鲜土壤的子样本用于确定土壤水分（24小时，105℃）。通过用搅拌器将20g新鲜土壤在190ml高压灭菌的软化水中混合2分钟来制备用于接种的土壤悬浮液。这被称为未稀释的10-1悬浮液。然后依次稀释该悬浮液，得到10-6和10-9的进一步稀释液，并将其加入已消毒土壤的袋子中。
用实时荧光定量PCR法测定了8周培养过程中所有稀释液的微生物丰度。在土壤培养8周后，将植物盆栽在含有培养土壤的0.5升盆中。使用当地的优势植物种J. vulgaris作为研究对象。通过组织培养繁殖一粒种子。由于组织培养通常被定义为无菌植物，因此使用克隆的这种清洁的植物进行进一步的实验是合理的。植物被随机放置在气候室(相对湿度70%,16h，20℃,黑暗8h，20℃)。每2天给予无菌去矿物质水，每2周添加10ml营养液，以避免营养限制植物的生长。水被添加到每个花盆底部的刻度上，那里的开口允许水进入花盆内。在种植时从大块土壤中取样。植物生长6周后，收集植物并轻轻摇动以除去松散粘附的土壤，然后用优质无菌刷除去残留土壤，收集根际土壤样品。样品保存于-20℃，以作进一步分析。
本实验的设计包括三种稀释剂，每种稀释剂对培养的块状土和根际土样品进行六次重复。在整个实验过程中，加入另一组重复三次的对照组，接种无菌去矿物质水。鉴于在植物生长期间土壤只被一层锡箔纸从大气中分离出来，我们认为这可能是会构成其他未知的细菌来源。然而，我们认为这不会对我们的结果产生重大影响，因为我们知道在接种(未稀释的)悬浮液后的8周预培养期后，大块土壤每克土壤中有超过109个细胞的完整生长群落。接种前灭菌后留在土壤中的细菌和细胞外DNA的影响，通过减去接种样品中检测到的未接种样品中发现的操作分类单元(OTUs)来解释这些情况。
统计分析
基于稀薄的OTU表进行α多样性计算，以比较给定采样努力水平下样品之间的差异。进行双因素方差分析以测试土壤处理（悬浮液、土壤和根际）和稀释液对多样性指数的影响。采用主坐标分析(PCoA)矩阵，利用生成的分类和功能丰度矩阵，对样本间的群落结构进行可视化。采用相似度分析法(ANOSIM)检测不同处理间细菌群落组成的差异。采用双向永久方差分析方法，研究了土壤处理(土壤和根际)和稀释对物种组成和功能多样性的影响。利用R中的ggtern包分析类群和功能基因相对丰度的差异。通过STAMP分析，得到了在土壤和根际之间的特定功能性状内负责分离的候选物种。为了更好地了解土壤和根际微生物的相互作用，进行了网络分析。利用Mothur实现的成分数据算法稀疏相关(SparCC)计算所有OTU之间的相关性。除了我们这里考虑的门内的多样性分析是基于家族水平，本研究其他的所有分析都是基于OTUs的。在这里，我们只考虑了最丰富细菌物种的，称为优势种，即相对丰度占10-1个未稀释土壤群落总丰度的42%的门；这里也包括在变形杆菌。
结果与讨论
这里应用的稀释方法是少数可用于控制复杂自然生态系统（如土壤）的微生物多样性的方法之一。事实上，我们的结果表明，稀释降低了土壤悬液中的微生物的生物多样性。目前的结果表明，稀释过程导致细菌多样性的减少，但在群落多样性方面，土壤和根际之间的差异性并不明显。在某些情况下，这里测量的根际多样性指数要比土壤中的大。此外，在根际检测到的物种数量有时比在块状土壤中要多。考虑到我们使用的是无菌植物，可以客观的说，这些植物并没有给群落引入大量的接种物。
图3 土壤和根际细菌群落组成和功能性状的PCoA。(a)基于分类数据的Bray Curtis相似性和基于2级相对丰度的功能性状的土壤和根际样品之间的变化。稀释土壤样本之间的差异的基础上,布雷柯蒂斯相似性分类数据(c)和功能特征(d)。根据布雷根际土壤的差异稀释样品柯蒂斯相似性分类数据(e)和功能特征(f)。相似的价值观相似的(分析)每个情节的左上角所示。(g)深灰色条表示分类数据，浅灰色条表示功能特征。误差条显示了6次复制的标准误差。
不同稀释程度的根际样品之间的相似性大于不同稀释程度的土壤样品之间的相似性(图3)。这表明根系中的群落集合是根的直接或间接选择性作用。这对于功能性特征来说尤其如此。然而,在土壤和根际群落之间，在物种组成（图3a）和功能性状（图3b）上都存在显著的差异性。根际土壤中样本间的差异似乎小于大块土壤中的差异，表明植物对群落结构具有均质效应。这种影响在群落的功能特征中比在其分类结构中更大。此外，与10-1个未稀释的样品相比，稀释样品中土壤和根际优势种的香农多样性差异不显著(表1)。这些结果表明植物在构建细菌根际群落方面具有选择性。在根际观察到的稀释液之间的功能差异仅存在于10-1个未稀释的和10-9个稀释的群落之间。这些观察结果表明，在不同多样性的群落中，细菌群的功能性状有相当大的重叠。这表明土壤中细菌群中存在着大量的功能冗余。
我们关于物种组成和功能性状的研究结果表明，植物基于特定的功能性状对根际微生物群落进行选择，这种选择可能直接发生，也可能通过非生物环境因子的变化而发生。根际富集过程选择了具有特定功能基因的微生物，特别是与转运体、EMP通路和氢代谢相关基因的微生物。这三个功能核心在根际中均有较高的表达，说明根际是根据功能性状来选择特定物种的。研究结果表明，特别是转运系统在根际中被发现出其实非常重要的。因此，我们将重点放在了转运蛋白基因上，通过STAMP分析更好地了解根际的功能选择过程。
图4 土壤和根际细菌群落功能特征。(a)三种稀释剂对土壤和根际功能基因群的相对丰度。基于散弹枪元基因组数据的功能基因相对丰度(泡沫数据库1级)，稀释倍数分别为10-1,10-6和10-9。每稀释一次，从土壤和根际中读取的总序列占总序列的百分比。误差条表示6个重复的标准误差，橙色星号(*)表示根际样品中含量显著丰富的类别(P<0.05)，蓝色星号(*)表示土壤样品中含量显著丰富的类别。(b) PCoA情节更加丰富的物种特定功能基因比根际土壤酶(细胞对压力的反应和碳水化合物的活动)和情节更加丰富的物种特定功能基因在根际土壤中(转运体基因,EMP途径和氢代谢)。相似度值显示在每个图的右上角。圆圈分别代表土壤和根际样本的聚类。(c)土壤和根际样品中携带转运体的科数的差异(Welch’s t检验;P<0.05)。
只有在具有特定功能性状的物种在根际样品中被过度表达时，才能发现土壤和根际样品之间存在的明显分离（图4b）。后者表明上述跨物种的根际选择过程不是随机的。作为一个特例，我们发现在根际中很少有含有转运体功能的特定物种被选择。在以前的盐焗报道中指出属假单胞菌科的物种的基因通常被认为是典型的根际生物，但我们的研究结果却表明其在土壤中更为丰富。我们得出的这一结果可能会被质疑该家族在植物微生物相互作用中的作用。
表1 土壤样品和根际样品中香农多样性丰富
尽管如此，我们得出的这一结论是合理的，在根际选择的核心功能基因并不局限于一个特定的分类群。且根际选择的是功能性基因，而不是分类学上的亲缘关系。实际上，如果根际的选择过程也是基于功能性状，并且这些特定的功能性状不是随机分布在这里检测到的所有细菌门上，这可能是对不同门的分类多样性变异的一种解释（如表1）。
网络分析显示，根际土壤中的相关性和潜在的关键物种多于土壤中的相关性（图4）。这表明根际土壤的网络结构比无根系的土壤更稳定，且连接也更复杂。
结 论
综上所述，我们的结果表明，稀释过程导致了细菌多样性的减少，但不能根据接种物的组成来预测在土壤和根际培养过程中群落组装过程的结果。土壤在塑造细菌群落方面具有很强的选择力，即使在接种各种悬浮液后，也会导致群落结构更加均匀化。进一步的选择发生在根际。而这种根际选择似乎是由特定的功能性状上所决定的。但是这种选择在多大程度上是由植物所控制抑或是由间接因素所造成的还有待深入研究。
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