科研 | 寒冷诱导胆固醇向胆汁酸转化并重塑肠道微生物组进而促进适应性产热（IF:32.6）
本文由李小艳编译，董小橙、江舜尧编辑。
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适应性产热是一种能量需求过程，由冷激活的米色和棕色脂肪细胞所介导，它需要增加产热细胞对碳水化合物以及脂蛋白衍生的甘油三酯和胆固醇的摄入来发挥作用。本文中我们研究了小鼠的冷暴露所引发的代谢过程，该过程结合了棕色脂肪组织（BAT）中的脂蛋白加工和通过旁路合成途径将胆固醇肝转化为胆汁酸。该过程依赖于肝脏中CYP7B1酶的诱导，导致胆汁酸的血浆水平和粪便排泄增加，伴随着肠道微生物群的明显变化和热量的增加。靶向胆汁酸合成和胆汁排泄的遗传和药理学干预，防止了粪便胆汁酸排泄的增加，改变了肠道的细菌组成并调节了产热反应。这些结果将胆汁酸鉴定为持续BAT活化条件下的重要代谢效应物，并突出了宿主对饮食诱导的肠道微生物群的胆固醇和能量代谢的相关性。
论文ID
原名：Cold-induced conversion of cholesterol to bile acids in mice shapes the gut microbiome and promotes adaptive thermogenesis
译名：冷诱导小鼠胆固醇向胆汁酸转化并重塑肠道微生物及促进适应性产热
期刊：Nat Med.
IF：32.621
发表时间：2017年
通信作者：Joerg Heeren
通信作者单位：德国汉堡埃普多夫大学医学中心生物化学与分子细胞生物学系
实验设计
实验设计流程图
实验内容
1 寒冷能改变肠菌群
膳食成分是肠道微生物组的决定因素，冷暴露需要更高的食物摄入量以满足增加的产热需求12。本实验中，我们结合饮食和寒冷（即通过用富含胆固醇的高脂饮食（HFD）和将小鼠分别保持在温热（30℃）和冷（6℃）条件下）来进行实验。首先，我们通过分析编码16S rRNA的DNA序列来分析温热和冷暴露小鼠的粪便微生物群。
基于加权UniFrac的多维尺度（MDS）分析揭示了温热与冷暴露小鼠微生物群之间的明显聚类（图1a），这与长时间冷暴露的小鼠的研究一致10,11。我们从微生物科水平考察其变化，发现相对于温热暴露，冷暴露小鼠中Lachnospiraceae和Deferribacteraceae家族成员的丰度较高，而梭菌和Porphyromonadaceae家族成员的丰度较低。从属的水平来说，与温热暴露相比，冷暴露小鼠Parabacteroides spp的丰度较高，而未被分类的Porphyromonadaceae家族成员的丰度明显较低（图1b）。这些差异可以追溯到物种水平的运算分类单位（OTU）的丰度，其在温热与冷暴露小鼠中显示出明显差异（图1c）。虽然我们没能观察到属的α多样性的差异（图1d），但我们确实注意到冷暴露导致物种水平的丰度降低和Shannon指数降低（图1e）。我们在食物喂养的野生型（WT）小鼠（补充材料图1a-e）和HFD喂养的糖尿病db / db小鼠中检测到类似的冷依赖性差异（补充材料图2a-e）。因此，这些数据清楚地表明冷暴露导致小鼠的肠道微生物组改变，不管是饲喂常规饲料或富含胆固醇（HFD）的小鼠。
图 1
2 寒冷诱导了胆汁酸的旁路合成途径
与增加的能量需求相一致，我们观察到冷暴露小鼠的食物摄入和粪便量高于温热暴露小鼠（图1f和补充材料表1a）。尽管饮食中脂质摄取较高，但由于脂蛋白（图1h）和胆固醇转运低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）（图1i）水平降低，冷暴露小鼠的血浆甘油三酯和总胆固醇水平较低（图1g）。接下来，我们通过口服灌胃放射性同位素标记的胆固醇，并观察到，与温热暴露相比，冷暴露小鼠的BAT中胆固醇摄取量较高，尽管血浆中放射性水平略低（图1j）。值得注意的是，肝脏中的胆固醇摄取也很高，在冷暴露小鼠的肝脏中占据了超过10％的给药剂量（图1k）。与已知的膳食胆固醇的低效吸收相一致，放射性示踪剂的主要比例仍然存在于小肠中，而与冷暴露无关（图1k）。总之，这些数据表明BAT中加速的脂蛋白加工和从产热脂肪组织向肝脏的胆固醇转运的增加，这与先前的研究一致17。
为了考察胆固醇的走向，我们通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量肝脏中的胆汁酸水平。我们观察到冷暴露小鼠中大多数未结合胆汁酸（UBA;图2a）和结合胆汁酸（CBA;图2b）的水平显著高于温热暴露小鼠，并且注意到最突出的诱导剂是胆酸（CA），熊去氧胆酸（UDCA）和鼠胆酸（MCAs）。然而，胆汁酸池的组成没有受到显着影响（补充材料图3a）。在胆囊中，与温热暴露相比，冷暴露小鼠中观察到更高水平的CBA（图2c），表明通过胆盐输出泵（BSEP;由Abcb11编码）存在有效的CBA排泄。与正常肝功能一致，冷暴露不会引起肝脏炎症或损伤（补充材料图3b，c）。
为了探究冷诱导的肝胆汁酸合成的基础，我们进行肝组织的mRNA分析以评估经典和胆汁酸旁路合成途径的组分的表达（图2d，e）。尽管Cyp7a1表达未改变，但冷暴露小鼠中Cyp7b1表达比温热暴露小鼠中高4倍（图2e），表明胆汁酸旁路合成途径的特异性上调。为了揭示FXR在冷诱导的胆汁酸合成中的潜在作用，我们用FXR激动剂Phenex20606（以下称为PX）30处理小鼠。正如预期的那样，在温热和冷暴露模型中，PX处理诱导Abcb11、Nr0b2的表达，下调SHP靶基因Cyp7a1和Cyp8b1。而另外一些对于胆汁酸合成和结合（分别为Cyp27a1和Baat）重要的酶不受PX处理的影响，但在冷暴露后略有提高。值得注意的是，我们在冷处理后观察到的Cyp7b1的上调不受FXR介导的负反馈环的影响（图2e）。与Cyp7b1的稳定表达一致，PX处理不影响冷诱导的肝胆汁酸水平的增加（图2f），而且只有一些会因PX敏感酶CYP8B1的激活而稍微降低的胆汁酸，如CA。在人体中，我们发现肥胖的2型糖尿病患者的CYP7B1肝脏表达低于非肥胖对照组，而CYP7A1和CYP8B1的表达没有差异（补充图5a-c），表明人体中存在旁路途径的代谢调节作用。
为了研究BAT在冷诱导的胆汁酸合成中的作用，我们使用β3-肾上腺素能受体激动剂CL316,243来激活室温饲养小鼠中的BAT。与未处理的对照组相比，CL316,243处理的小鼠中Cyp7b1的表达升高，（图2g）与肝胆汁酸的增加相关（图2）。2h和补充图6a，b）。
在温热暴露的野生型（WT）小鼠中，与用表达GFP的对照组AAV（AAV-GFP）相比，腺相关病毒（AAV）介导Cyp7b1过表达的基因介入导致了肝胆汁酸的适度升高（图2i和补充材料图6c）。相反，与WT小鼠相比，Cyp7b1-/-小鼠肝脏胆汁酸水平的冷依赖性诱导减弱（图2j和补充图6d，e）。冷暴露诱导BAT中Cyp27a1的表达（图2k）并导致血浆中27羟基胆固醇（图21）量的增加，其是肝CYP7B1的底物。值得注意的是，27-羟基胆固醇在冷暴露的Cyp7b1-/-小鼠的肝脏和血浆中没有积累（补充材料图6f，g），这可能是因为它的大部分被排泄在粪便中（图2m）。总之，这些数据表明，在BAT活化的条件下，旁路途径被选择性上调并增加胆汁酸合成。
图 2
3 寒冷通过CYP7B1的作用加速粪便胆汁酸的排泄
为了进一步探索胆汁酸的命运，我们定量了温热和冷暴露小鼠粪便中胆汁酸的水平。冷暴露小鼠的胆汁酸排出量远高于温热暴露小鼠（图3a，b）。值得注意的是，一些CBA，尤其是tauro-α/β-MCA（T-α/β-MCA）和tauro CA（TCA），高达40倍。UBA水平受影响较小，增加了两倍（图3a，b）。在Cyp7b1-/-小鼠中，冷诱导粪便CBA升高的现象消失了，并且一些胆汁酸的浓度甚至更低（图3c，d）。相反，与AAV-GFP对照相比，AAV介导的Cyp7b1过表达导致粪便中胆汁酸种类增加（图3e和补充图7a，b）。值得注意的是，这种效应在温热暴露条件下不存在，但在22°C，尤其16°C时胆汁酸上升明显（图3e和补充材料图7a，b），表明在低温条件下，增加饮食摄入量和胆固醇BAT依赖性加工过程决定了CYP7B1介导胆汁酸合成的效率。
为了研究冷暴露小鼠中粪便CBA水平提高的原理，我们首先定量了顶端钠胆汁转运蛋白（ASBT）的回肠表达，这是CBA有效再摄取来作为肠肝循环一部分所需的。冷暴露导致ASBT的mRNA（Slc10a2;图3f）以及蛋白表达水平（图3g）的升高，这种现象在Cyp7b1-/-小鼠中消失（补充材料图7c，d）。此外，冷暴露导致门静脉（图3h）和全身（图3i）血液中胆汁酸水平升高的趋势。总之，这些数据反驳了CBA再摄取能力下降是导致粪便胆汁酸水平升高的原因。
增加粪便中CBA浓度的另一种机制可能是由于胆汁盐水解酶（BSHs）导致的胆汁酸水解减少，该酶是由许多肠道细菌表达的26。为了解决这一假设，我们通过使用抗生素来消耗肠道微生物群。相对于未处理的对照组，这种干预导致温热和冷暴露小鼠粪便中CBA含量更高（图3j，k），这是抗生素处理根除了肠道BSH活性的原因（图3l）。尽管抗生素治疗不影响与胆汁酸代谢相关基因的表达（补充材料图8a），但是肝UBA，而不是CBA水平会降低（补充材料图8b，c）。值得注意的是，我们观察到在没有抗生素的冷暴露小鼠中比在温热暴露小鼠中有更高的BSH活性（图3l），导致粪便中更高的牛磺酸（图3m）。总的来说，这些结果表明，冷暴露后，与其说是BSH水解活性的降低，还不如说是ASBT的饱和导致了粪便中CBA的排泄增加。
图 3
4 胆汁酸的排泄依靠于BAT-肝脏胆固醇轴
冷激活的BAT有效地处理膳食脂质，并促进受体介导的肝脏富含胆固醇的残余物的摄取。因此，与冷暴露WT小鼠中循环脂质的下降相反（图1g-i），我们观察到与温热暴露小鼠相比，冷暴露小鼠有更高的循环胆固醇脂蛋白，这些小鼠是缺乏LDL受体的（LDLR-/-）（图4a,b）。当我们将Ldlr-/-基因型与编码替代肝脏脂蛋白受体LDLR相关蛋白1（Lrp1）的基因的肝脏特异性敲除结合时，我们观察到甚至更高的脂蛋白水平（图4c，d），表明在两种受体都确实的情况下，脂质残余物的清除下降。值得注意的是，冷诱导的Ldlr-/-小鼠粪便胆汁酸排泄增加仅为WT小鼠的50％，并且在缺乏LDLR和肝LRP1的小鼠中几乎消失（图4e-g）。总之，这些发现表明粪便胆汁酸排泄依赖于肝胆固醇，其是由冷激活的BAT产生的餐后脂蛋白递送到肝脏的。
图 4
为了评估膳食胆固醇对冷诱导的胆汁酸合成的贡献，我们首先通过抑制用依泽替米贝（EZ）来抑制肠胆固醇转运蛋白Niemann-Pick-1-like 1（NPC1L1），从而阻断膳食胆固醇的吸收。值得注意的是，冷暴露和EZ处理的结合使用，导致血浆脂质和富含胆固醇的脂蛋白水平较低，甚至比仅仅冷暴露的小鼠胆固醇含量还低（图5a，b）。
与EZ处理后饮食中胆固醇摄取和肝脏脂质水平的降低相一致（图5c），我们观察到编码胆固醇合成途径（Hmgcr）和Ldlr限速酶的基因的代偿性肝脏上调（图5d），而Cyp7b1的表达未受影响（补充材料图9a）。冷暴露并结合EZ处理的小鼠的肝胆汁酸水平与冷暴露对照小鼠的肝胆汁酸水平相当（图5e和补充材料图9b，c）。相反，冷暴露后EZ处理小鼠的粪便胆汁酸浓度不高，胆汁酸水平几乎与温热对照小鼠相同（图5f-h），表明饮食胆固醇摄取决定了冷诱导粪便胆汁酸的排泄。用EZ处理后能导致更高的粪便胆固醇含量而不影响食物摄入或粪便量（补充材料图9d-f）。冷暴露引起的膳食胆固醇摄入升高伴随着粪便中胆固醇含量的增加（补充材料表1b）。在使用放射性示踪剂的代谢研究基础上（图1j，k），我们研究了胆固醇的吸收及其向胆汁酸的转化，其中我们从粪便中测定（补充材料表1b），并观察到温热处理小鼠中17.1％的转化率，而冷暴露导致转化率增加70％；因此，在冷暴露小鼠中，吸收的胆固醇29.2％转化为胆汁酸。考虑到较高的胆固醇吸收量，冷暴露小鼠产生的胆汁酸量是温热暴露对照小鼠的5.8倍。
图 5
5 在寒冷环境中饲养的小鼠胆汁酸改变了肠菌群结构
可以想象，宿主产生的与冷暴露相关的内源性代谢物，如胆汁酸，对体内肠道细菌有影响27。因此，我们推测冷诱导的胆汁酸水平将肠道细菌有选择性，从而决定冷暴露小鼠中的微生物组。为了测试这种可能性，我们对结合或不结合EZ处理的温热和冷暴露小鼠的粪便样品进行16S rRNA基因测序。MDS分析显示冷暴露和温热暴露组有明显差异（图5i），而EZ处理的冷暴露小鼠与未处理的温热暴露小鼠相似（图5i）。经EZ处理的温热暴露组群体聚集在与未处理的冷暴露组相对的位置，与未处理的温热暴露组相比较，这与在EZ处理的温热暴露小鼠中观察到的较低的粪便胆汁酸水平一致。（图5f）。然而，聚类分析显示未用EZ处理的冷暴露小鼠与其他组分离开来（补充材料图9g）。为了解决膳食胆固醇的作用而不控制其吸收率，我们进行了一项研究，该研究使用的是饲喂不含胆固醇或含有胆固醇的食物的小鼠。相对于温热暴露对照组，冷暴露小鼠在两种饮食中显示出肠道微生物组的显著变化（图5j和补充材料图10a，b）。值得注意的是，即使在没有膳食胆固醇的情况下，与温热暴露小鼠组相比，冷暴露小鼠中观察到显著更高的粪便胆汁酸排泄（补充材料图10c，d），表明内源合成的胆固醇足提供冷诱导产生的胆汁酸。尽管β3-肾上腺素受体激活导致Cyp7b1的诱导和肝脏中胆汁酸水平升高（图2g，h），但我们只是观察到粪便胆汁酸水平升高的趋势，但对肠道微生物组没有明显影响（补充材料图10e）。考虑到小鼠的昼夜食物摄入模式，由饮食提供的CL316,243对β3-肾上腺素受体间歇性的刺激可能解释了不太明显的影响。接下来我们想在Cyp7b1-/-小鼠中观察到的冷诱导粪便胆汁酸的损失（图3c，d）是否对肠道微生物群的组成有影响。出乎意料的是，我们观察到WT小鼠的肠道微生物群与Cyp7b1-/-小鼠的肠道微生物群显著差异，与其饲养环境的温度无关（图5k）。在MDS图中观察到的基因型对肠道微生物组的主要影响也许可以解释冷暴露在WT小鼠中相对弱的影响的现象。值得注意的是，Cyp7b1过表达与肠道微生物组的组成变化有关。我们观察到肠道细菌的作用存在于22℃暴露的小鼠中，但不存在于温热暴露小鼠中（图5l，m和补充材料图11a-c），表明Cyp7b1的上调和通过活化的BAT加速对胆固醇代谢对肠道微生物组的变化很重要。为了研究冷诱导的胆汁酸改变肠道微生物组的相关性，我们用另外的遗传模型Abcb4-/-（也称为Mdr2-/-）小鼠进行了实验，这些小鼠缺乏胆管侧膜转运蛋白MDR2，导致冷诱导粪便胆汁酸水平变化的消失（补充材料图11d）。与在温热和冷暴露的Mdr2-/-小鼠的粪便中观察到的胆汁酸水平一致，我们没有观察到肠道微生物群的差异（图5n和补充材料图11e）。总之，这些数据表明，肠道微生物组的冷诱导变化取决于宿主对胆汁酸的合成和胆汁排泄。
6 由CYP7B1衍生的胆汁酸能促进机体产热
我们已知外源性胆汁酸能激活小鼠和人类的BAT。为了研究冷暴露后较高水平的内源性胆汁酸的热代谢后果，我们研究了饮食胆固醇摄取及其随后通过CYP7B1的转化是否会影响产热。与此概念一致，与未处理对照组相比，EZ处理的冷暴露小鼠中的血浆胆汁酸水平降低（补充材料图12a，b），这与冷暴露WT和db/db小鼠体温降低有关（图6a，b）。相反，膳食中添加胆固醇会导致血浆中胆汁酸水平和体温（图6c）升高（补充材料图12c，d）。为了研究在此背景下的胆汁酸旁路合成途径，我们分析了冷暴露WT和Cyp7b1-/-小鼠的产热参数。相对于WT对照组，Cyp7b1-/-小鼠显示出较高的BAT脂质含量（图6d）、较低的产热基因的表达（图6e，f）和较低量的线粒体解偶联蛋白1（UCP1），这对于在BAT和腹股沟WAT中的调节性产热是必需的（图6g）。与自适应产热受损相一致，我们通过间接量热法观察到Cyp7b1-/-小鼠消耗的O2显著性减少，这表明能量消耗减少（图6h，i），并且我们观察到随着外周环境温度的逐渐降低，小鼠体温呈现降低（图6j）。
此外，与对照组相比，AAV介导肝脏中Cyp7b1过表达（补充材料图13a）引起BAT和腹股沟WAT中产热相关基因的表达增加（补充材料图13b，c）。这伴随着更高的O2消耗（图6k，1），更大的尾部热量损失（补充图13d）和更高的体温（图6m）。总之，这些数据表明胆固醇由CYP7B1转化为胆汁酸，并通过棕色和米色脂肪细胞来调节适应性产热。
图 6
讨 论
总所周知，肥胖和HFD与肠道微生物群的变化有关。这些反过来通过循环代谢物和激素的改变对慢性代谢疾病的发展和进展产生影响2-6。最近的研究表明，冷暴露导致米色和棕色脂肪细胞的产热活化与肠道微生物组的变化有关，这与肠道有益的代谢结果有关10,11。在这里，我们证明了冷暴露后内源性和膳食胆固醇代谢的加速导致了胆汁酸通过旁路途经合成增加。这导致胆汁酸排泄显著升高和肠道细菌组成的明显变化，这也为冷诱导能量消耗增加并改变肠道微生物组提供一个机制。此外，发现胆固醇摄入及其在肝脏中向胆汁酸的转化来激活棕色和米色脂肪细胞，这表明饮食诱导的产热的作用。我们研究的结果总结在了BAT活化如何刺激胆固醇流出和转化为胆汁酸的模型中，该过程塑造了肠道微生物组并促进适应性产热（补充材料图14）。
大部分成年人保留了BAT功能性31-35的发现，已经把适应性产热作为增加能量消耗的一种最有前景的方法14,36。在激活的BAT中，膳食葡萄糖和甘油三酸酯在热量产生中作为燃料来满足高能量的需要15,16,37。这反过来导致食欲增加和食物摄入增加，从而导致摄入可能有害的食物成分。胆固醇是典型的富含能量丰富的饮食成分，特别是不能用于产热，并且原则上可以在动脉中累积，因此增加心血管类疾病。然而，我们以前表明，小鼠BAT的持续激活能导致动脉粥样硬化减少17。我们目前的研究表明，过量的膳食胆固醇部分转化为胆汁酸，随后通过粪便排泄去除，从而有助于冷暴露小鼠的全身胆固醇体内平衡。值得注意的是，最近的研究表明，冷暴露会引起肠道微生物群的改变，这与改善代谢参数有关[10,11]。然而，冷诱导微生物群重塑的触发因素仍然未知。在这种情况下，值得注意的是，胆汁酸不仅通过促进肠道脂质摄取参与能量收集，而且还与肠道细菌相互作用26。值得注意的是，我们发现，冷暴露提高了粪便胆汁酸的水平，而且肠菌群的变化能被减弱，其是通过使用依泽替米贝（一种具有确定的抗动脉粥样硬化特性的降胆固醇药物）来抑制肠上皮转运蛋白NPC1L1来减弱。这表明增强的胆固醇分解代谢导致粪便胆汁酸增加，对于观察到冷暴露小鼠的肠道微生物群的变化是重要的。从机制上讲，除了直接抑菌作用27之外，增加的胆汁酸水平可能可以通过牛磺酸间接改变肠道微生物组，我们发现这是由于胆汁酸去结合作用增强所致。为支持这一观点，最近发现牛磺酸以炎性体依赖性方式引发防御素的肠道分泌39。无论如何，这种机制还取决于肝脏中胆汁酸合成的增加。从整体来看，我们提供了以下概念的证据：由宿主而不是饮食本身处理膳食成分（例如胆固醇）决定了肠道微生物组的组成。
最近，在WT小鼠中，冷暴露导致了Cyp7b1和一些胆汁代谢相关基因的诱导。在我们的研究中观察到冷暴露或β3肾上腺素能受体激动后，Cyp7b1的诱导表明BAT-肝脏轴调节肝脏基因的表达和产热能力40,41。此外，由于无菌小鼠具有较高的肝Cyp7b1水平42,43，肠道微生物群释放的因子可能直接或间接通过BAT激活调节Cyp7b1的表达。本研究中，我们使用Cyp7b1-/-小鼠，证明了肝Cyp7b1诱导作为冷诱导胆汁酸合成增加的主要驱动因素的相关性，这种合成增加了能量的消耗。这种增强胆固醇分解代谢的过程是由冷激活BAT加速脂蛋白加工引发的，其刺激胆固醇通向肝脏。此外，我们证明，与CYP7A1不同，经典途径18的限速酶CYP7B1不会被FXR激动抑制。因此，CYP7B1不受由胆汁酸水平升高调控的经典负反馈所限制。这是特别值得注意的，因为它可以使身体保持胆固醇稳态，尽管在冷暴露条件下，胆汁中的胆固醇大量增加转化为胆汁酸。虽然在冷暴露小鼠中诱导Cyp7b1的确切机制仍有待阐明，但这是首次证明胆汁酸旁路合成途径的生理调节的报道。值得注意的是，在患有2型糖尿病的受试者中CYP7B1表达降低，这表明旁路途径在人类代谢稳态中的作用。然而，先前的研究表明，患有2型糖尿病的人血浆中CYP8B1衍生的胆汁酸水平较高。在干预研究中剖析胆汁酸合成途径将是有意义的，包括冷激活BAT，并在健康个体和糖尿病患者中进行比较。
总之，我们的研究结果表明，增加的胆汁酸水平有助于米色和棕色脂肪细胞对肥胖相关合并症的有益作用。从机制角度来说，升高的胆汁酸水平调节产热反应，这已经在小鼠和人的BAT中出现11,22,24,25。此外，胆汁酸还可以直接促进骨骼肌24的产热活性，这可以解释在冷暴露后2型糖尿病患者的BAT和肌肉中观察到的葡萄糖摄取增加46。以后的研究有必要解决治疗相关的问题，即有益的冷介导的代谢作用是由胆汁酸直接作用于TGR5和其他受体的，还是间接地通过肠道微生物组的组成变化来介导。
注：文中参考文献与原文一致。
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