科研 | 南京土壤所孙波：生物炭负激发效应的微生物关键物种竞争作用机制
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生物炭施用被证实是一种广泛又有效的农业策略，它可以通过引起负激发效应从而促进土壤有机碳（SOC）的封存，但是由生物质炭诱导的负激发效应的程度和生物学机制仍未被完全了解。传统研究认为生物炭通过影响土壤微生物的生物量和群落组成影响了SOC的矿化，但关于生物炭如何影响土壤微生物之间的网络关系及其关键物种之间的相互作用的研究仍是很少。本文的研究人员特别关注土壤细菌和真菌群落的多样性和网络结构与SOC矿化之间的关系，基于生物炭田间试验结合稳定性同位素核酸探针技术（DNA-SIP）观察到生物炭施用后，网络关键物种与其他微生物间的竞争性交互作用提高了细菌和真菌多样性，降低了碳水化合物分解代谢活性和土壤呼吸熵。本研究对了解生物炭调控土壤有机碳封存能力的生物学机制提供了至关重要的意义。
论文ID
原名：Competitive interaction with keystone taxa induced negative priming under biochar amendments
译名：生物炭负激发效应的微生物关键物种竞争作用机制
期刊：Microbiome
IF：10.575
发表时间：2019年
通信作者：孙波
通信作者单位：南京土壤研究所
实验设计
田间试验在位于中国山东省临沂市的烟草田站（35°51'36“N，118°37'48”E）进行。在一个完全随机的区块中布置了15个试验区（5米长×2米宽），包括5个处理，重复3次：（1）无肥料（CK），（2）常规施肥（CF），（3）低生物炭施用，（4）中量生物炭施用，和（5）高量生物炭施用。在2016年8月初收获后，在0-20cm的深度收集每个地块的土壤样品，收集田间后，将新鲜样品置于冰上并立即运送到实验室，在那里将它们过筛（2mm）以除去可见残留物然后均质化。将土壤样品细分为三个子样品，用于测定土壤理化性质，PLFA，和Illumina测序。
从存储在-80℃的部分收集每个处理的子样品。在50mL无菌玻璃血清小瓶中建立具有20g新鲜土壤的微观世界，其用膜密封以允许空气交换。将微观世界分成重复的组，其中补充有10mM 12C-或 13C-标记的葡萄糖，然后在28℃下培养15天，随后进行微观世界DNA样品的密度梯度级分的分离和qPCR定量分析。
本研究使用Biolog EcoPlates测量了微生物碳代谢活动，并确定了q CO 2作为土壤呼吸除以微生物生物量。将25g土壤（干重当量）润湿至60％保水能力，并在25℃的有氧条件下在125-mL罐中温育。所有的罐子在7天的时间内保持与预培养相同的条件。在培养期间的0.5,1,3,5,7,10,15,20,25和30天，使用气密注射器从罐的顶部空间收集来自每个处理的三个重复的气体样品。在气体取样后，从罐中取出塞子，并使用铝箔再次密封罐子。该CO 2用配备有火焰离子化检测器的HP 6890系列气相色谱分析浓度。将三个含有相同重量的纯硅砂的额外罐子平行分析为空白。
结果
1.土壤理化性质和SOC矿化
生物炭施用显着影响土壤理化条件（F（4,11）=2.67-73.56，P<0.05）。相对于常规施肥（CF），中量、高量生物炭（MB和HB）施用显着提高了土壤pH，SOC，总氮，总磷，有效钾和有效磷。当土壤吸水量高于0.03MPa时，三种不同量生物炭施用处理中的土壤水分容量（SMC）急剧增加。土壤代谢商（qCO2）和微生物碳代谢（AWCD）均可作为有机碳矿化的评价指标。与CF处理相比，生物炭施用后AWCD和qCO2值平均分别显著降低36.8%和16.3%（图1，P<0.05），MB处理中的AWCD和qCO2值最低。碳水化合物利用率与总体AWCD值趋势相似（图1，P < 0.05）。然而，在其他五种碳源（羧酸、氨基酸、酚酸、胺或聚合物）的利用上处理之间并没有显著差异。
图1生物炭施用对微生物碳代谢活动（a）和土壤代谢熵（b，qCO2）的影响。基于六个特定碳族的碳源利用率由Biolog EcoPlates分析，包括碳水化合物，羧酸，氨基酸，聚合物，酚酸和胺/酰胺（c）。
2.土壤细菌和真菌群落的生物量，多样性和组成
对土壤样品进行磷脂脂肪酸（PLFA）分析以确定微生物生物量。MB和HB处理中总PLFA测量的微生物生物量显着高于CF处理。与总PLFA相似，MB和HB处理中细菌（21.3％和34.2％），革兰氏阴性菌（29.1％和47.5％），革兰氏阳性菌（9.1％和15.1％），放线菌（13.8％和17.8％）和真菌（14.2％和31.8％）的生物量显着增加。
通过Illumina测序16SrRNA和ITS基因扩增子检测土壤细菌和真菌群落的多样性和组成。与无肥料（CK）和CF处理相比，MB和HB处理显着增加了细菌和真菌多样性（Shannon指数和Chao1丰富度）（图2）。
图2生物炭施用改变了田间试验中的细菌（a）和真菌（b）多样性。
3.细菌和真菌共生网络
为了确定未施用（CK和CF）和施用生物炭（LB，MB和HB）处理中土壤细菌和真菌群落的共生模式和生态位分区，研究人员接下来构建了细菌和真菌网络。在生物炭施用后，网络中负相关与正相关的比率增加（图3），细菌和真菌网络中的多种拓扑性质（节点和边缘的数量、平均连通性和平均聚类系数方面）明显发生变化。
图3基于现场实验和稳定同位素探测（SIP）微观世界中的相关性分析，未施用（CK和CF）和施用生物炭（LB，MB和HB）处理的细菌共现网络。
图4 基于现场实验和稳定同位素探测（SIP）微观世界中的相关性分析，未施用（CK和CF）和施用生物炭（LB，MB和HB）处理的真菌共现网络。
细菌和真菌网络中的模块可以进行分析以发现重要的模块-性状关系。结果表明，细菌和真菌网络均可分解为较小的模块，模块（Module eigengenes）与SMC和pH值有较强的相关性。在施用生物炭的网络中，细菌模块I和V以及真菌模块II和IV与碳水化合物利用和qCO2正相关（图5）。然而，细菌模块I和II以及真菌模块II显示出与碳水化合物分解代谢和qCO2的负相关性。值得注意的是，细菌模块I和II以及真菌模块II分别与细菌和真菌的多样性呈正相关。此外，根据模块内连接性Z和模块间连接性P，各个节点在微生物网络中显示出不同的角色。对于未施用生物炭的网络，细菌属Sphingomonas（Alphaproteobacteria）和真菌属Aspergillus（Eurotiomycetes））被检测为模块中心。有趣的是，这种统计学上确定的关键物种在自身模块中与其连接节点以及碳水化合物分解代谢和qCO2都显示出正相关关系（图3和4，表1）。对于施用生物炭的网络，细菌属Arthrobobacter（Actinobacteria）和Gemmatimonadaceae（Gemmatimonadetes）和真菌属Chaetomium（Sordariomycetes）和Penicillium（Eurotiomycetes））被类似地指定为模块中心。然而，这些关键物种与自身模块中与其连接节点以及碳水化合物分解代谢和qCO2具有强烈的负相关性（图3和4，表1）。
图5 施用生物炭或不施用处理下模块（Module eigengenes），土壤性质和碳水化合物分解代谢与土壤代谢熵之间的相关系数（qCO2）。
表1 在未施用和施用生物炭处理中，细菌和真菌网络中的关键物种
4.土壤性质和微生物群落影响SOC动态
土壤细菌和真菌群落的多样性和丰富度与SMC和pH呈正相关（r=0.732~0.937，P <0.01），但与碳水化合物利用和qCO2呈负相关（r=-0.927~-0.720，P<0.01）。然而，细菌和真菌生物量显示与碳水化合物分解代谢和qCO2没有显着相关性（r=-0.490至-0.271，P>0.05）。随机森林模型用于评估影响碳水化合物分解代谢和qCO2的潜在重要因子，结果显示SMC和pH是碳水化合物利用和qCO2的两个主要决定因素。当去除SMC的预测值时，碳水化合物利用率和qCO2的均方误差分别增加了13.6％和15.7％，当去除土壤pH值的预测值时，均方误差分别增加了10.9％和13.3％。细菌和真菌多样性（Shannon指数）对碳水化合物利用和qCO2的贡献比网络（Module eigengenes）更显着。
结构方程模型（SEM）进一步用于评估土壤性质和土壤细菌和真菌群落对未施用和生物炭施用处理中的SOC矿化的直接和间接影响。在未施用生物炭的处理中，土壤细菌和真菌网络（Module eigengenes）与碳水化合物分解代谢呈正相关（图6）。SMC对生物炭施用处理中的碳水化合物分解代谢产生了直接的负作用。重要的是，具有关键物种的模块可能比没有关键物种的模块对土壤细菌和真菌网络的贡献更大（图6））。细菌和真菌多样性（Shannon指数）与网络（Module eigengenes）正相关，但与生物炭施用处理中的碳水化合物分解代谢呈负相关。SEM表明细菌多样性对碳水化合物分解代谢的影响大于真菌多样性。
图6 未施用生物炭（a）与施用生物炭（b）处理中土壤性质和细菌和真菌群落对碳水化合物代谢和土壤代谢商（qCO2）的影响。
5.DNA-SIP实验
本研究进行了SIP实验以追踪在未施用和施用生物炭的网络中能够利用碳水化合物的细菌和真菌。在用13C-葡萄糖培养期间成功标记了靶向的细菌和真菌群体。结果显示13C培养样品的细菌和真菌群落的多样性比12C-对照组低，这表明与整体微生物群落相比较只有一部分细菌和真菌使用葡萄糖作为碳源。事实上，大约有一半检测到的细菌(46.5%)和真菌(54.7%)属与葡萄糖利用有关。此外，碳水化合物分解代谢群体的靶向性在生物炭施用处理中明显高于未施用处理。对于细菌群体，Actinobacteria（52.4％和19.6％），Alphaproteobacteria（16.2％和32.5％），Gammaproteobacteria（6.6％和9.2％）和Betaproteobacteria（4.4％和6.6％）分别在13C培养的样品和12C对照样品中占优势。
在未施用和施用生物炭的网络中，绝大多数总节点被确定为潜在的利用葡萄糖的细菌（80％和84％）和真菌（76％和79％）。在这些潜在的13C-葡萄糖利用群体中，研究人员检测到了未施用和施用生物炭的网络中的所有的细菌和真菌关键物种。未施用生物炭的网络中，细菌和真菌的模块中心与其各个模块中的连接节点呈现正相关，而施用生物炭网络中的模块中心与其链接节点呈负相关（图3和图4）。
讨论
在短期田间试验中，研究人员选择了三种生物炭施用量来评估生物炭对土壤特性的影响。结果表明物炭修正显着增加了土壤pH值，持水能力和易于获得的底物。由于生物炭的碱性pH值，生物炭改良剂会立即增加邻近土壤的pH值，这在很大程度上依赖于原料材料的性质和热解温度。生物炭可以同时促进SMC和微生物对水的利用，这主要归因于体积密度的降低和大孔隙率和孔隙率的增加。此外，表面电荷的生物炭特性可以促进水和营养物质从块状土壤转移到孔隙结构中。
MB和HB处理中的pH和SMC增加可以增强微生物孢子萌发，定殖和繁殖速率，从而增加细菌和真菌生物量。施用生物炭的处理中物理化学性质和底物利用的变化将不同地调整土壤细菌和真菌群落的组成和网络。PCoA结合网络分析证实，施用生物炭土壤中细菌和真菌群落的组成和网络结构与未施用生物炭土壤中的组成和网络结构有显着差异（图3和图4）。施用生物炭可以通过促进革兰氏阳性细菌和腐生真菌的丰度直接引发细菌和真菌群落结构的变化。这些结果表明，真菌和细菌类群对其代谢需求的优选能源的不同反应会导致其中一些微生物群体变得具有竞争优势。施用了生物炭后，细菌和真菌网络的耦合链呈负向增加，表明在它们获得底物时存在拮抗或竞争性的相互作用。网络中的模块表明其中的微生物种群具有相似的生态位和功能相互依赖性。土壤pH和SMC被解释为拓扑网络特性（网络的复杂性和模块性）的主要预测因子：（1）施用生物炭处理增加的pH和SMC直接降低了对土壤细菌和真菌的生理约束，改变了相互作用关系。（2）土壤pH通常与各种土壤特性（例如，养分可用性和有机碳特征）显着相关，并间接调节微生物网络结构。
为了推进对SOC封存的解释性和预测性理解，研究潜在的细菌和真菌群落如何在其多样性中发生变化至关重要。传统的二分法支持由资源竞争产生的不同的自然选择，特别是当微生物类群在土壤微环境中具有类似的资源需求或生态位时将其作为快速多样化的重要驱动力。在生态群落中，功能多样性和系统发育多样性通常被认为是通过种内和种间的竞争相互作用来促进的。本研究发现生物炭对细菌和真菌多样性的影响可能是由网络中的关键物种介导的。一般认为交互强度分布不均匀的现象在网络中普遍存在，例如，特殊类群之间可能存在紧密的联系，从而相对于联系较差的类群，这种紧密联系的特殊类群对网络结构和多样性做出更强的贡献。利用网络拓扑数据，分别在生物炭施用后的细菌和真菌网络中观察到节肢杆菌属（Arthrobacter）和毛壳霉属（Chaetomium）作为关键物种。当生物炭施用后的网络被划分为多个模块时，细菌和真菌的关键物种可能与各自模块中相互联系的成员表现出激烈的竞争关系。这些假定的关键物种在分解顽固的生物炭衍生的碳和更有效地捕获有限的资源方面具有竞争特征和优势。DNA-SIP证明了随着细菌和真菌多样性的不断增加，关键物种之间呈现特异性竞争关系。总的来说，这些结果表明具有互斥能力的功能性关键类群可能会增加生物炭施用处理中的细菌和真菌多样性。
本研究表明，负SOC激发效应与细菌和真菌多样性增加呈正相关。尽管土壤pH和水分已被报道为SOC动态的关键驱动因素，但土壤细菌和真菌群落是陆地SOC循环的核心支柱，介导了绝大多数SOC矿化。关键物种的功能特性常常被认为对确定为微生物群落与SOC动态之间的关系具有特殊的生态学意义。生物炭诱导关键物种的竞争性交互作用通过抑制碳水化合物分解代谢和qCO2而有利于SOC的积累，研究为建立生物炭调控土壤有机碳封存能力的方法提供了生物学依据。
评价
本研究揭示了生物炭施用后引起负激发效应的微生物关键物种竞争作用机制。生物炭施用后将细菌和真菌网络中的关键物种进行了竞争，促进了微生物多样性，随后减少了碳水化合物分解代谢和qCO2。这一发现将这一发现将促进SOC动力学激发效应理论的新发展。
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