科研 | 南方医科大学珠江医院高毅：原发性肝癌不同分期的肠道菌群失调程度与预后的关系分析
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近年来，相关研究报道肠道菌群失调与原发性肝癌密切相关，通过分析肠道菌群失调可以来评估原发性肝癌的早期诊断。然而，菌群失调异常程度与原发性肝癌的预后之间的关系尚不清楚。由于原发性肝癌常常伴有菌群失调，而失调的菌群可以进一步增加体循环中内毒素和其他有害细菌物质，进一步增加了肝损伤。基于此，研究者推测菌群失调的程度可能随着肿瘤进展阶段的增加而增加。为了验证该假设，本文中研究者引入了一个更综合的指数称为失调程度(degree of dysbiosis, Ddys)，并通过对16S rRNA基因扩增子的高通量测序，研究了原发性肝癌发生发展过程中肠道菌群的失调程度。我们的研究结果表明，与健康个体相比，原发性肝癌患者的粪便菌群中促炎细菌增多。与健康对照组相比，原发性肝癌患者的Ddys明显增加。此外，Ddys有随原发性肝癌发展而有增加的趋势，但在原发性肝癌不同分期间差异不显著。该研究为原发性肝癌治疗中靶向肠道菌群的应用提供了重要的参考。
论文ID
原名：Analysis of the Relationship Between the Degree of Dysbiosis in Gut Microbiota and Prognosis at Different Stages of Primary Hepatocellular Carcinoma
译名：原发性肝癌不同分期的肠道菌群失调程度与预后的关系分析
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.259
发表时间：2019
通信作者：高毅
通信作者单位：广东省人工器官与组织工程技术研究中心，南方医科大学珠江医院
研究结果
1 所有受试者的基线特征
共收集110例患者粪便样本，进行MiSeq测序，经严格排除，其中有86例(原发性肝癌I期23例)；原发性肝癌II期13例；原发性肝癌III期30例；原发性肝癌IV期2例；最终纳入18例健康对照组)进行进一步分析。由于III期和IV期都属于肝癌进展期，因此将来自肝癌III期和IV期患者的样本进行合并分析。不同分期的原发性肝癌患者与健康对照组相比，其年龄、身高、体重指数和收缩压均无显著性差异。然而，不同阶段原发性肝癌患者的空腹血糖和白蛋白水平明显低于健康对照组，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)也明显升高。此外，原发性肝癌III期血清总胆红素(total bilirubin, TB)水平也明显高于健康对照。
表1原发性肝癌患者和健康对照者的基本生理指标。
2 原发性肝癌患者肠道菌群中变形杆菌增多
尽管与健康对照组相比，原发性肝癌(III和IV阶段)患者的肠道菌a多样性显著降低(图1 A、B)，然而未发现早期原发性肝癌和健康对照组间存在显著差异 (图1 A、B)，该结果与之前的相关报道相一致，尽管他们发现早期原发性肝癌与肝硬化相比，微生物多样性明显增加。在不同组别间，除了极小的未分类序列外，测序得到的OTUs隶属于38门。然而，其中只有10个门是优势门，相对丰度在至少一个样本中超过1%，分别为Actinobacteria, Bacteroidetes, Euryarchaeota, Firmicutes, Fusobacteria, Planctomycetes, Proteobacteria, Synergistetes, Tenericutes 以及 Verrucomicrobia (图1 C)。虽然与健康对照组相比，厚壁菌门的相对丰度没有明显变化，但是原发性肝癌II期和III期患者的变形杆菌明显增多(图1 C)。由于多数促炎细菌来自变形杆菌，而许多益生菌来自厚壁菌门，这一结果提示促炎细菌伴随原发性肝癌的发生发展，这一结果提示促炎细菌伴随原发性肝癌的发生发展。与此同时，变形杆菌科的许多促炎细菌，如肠杆菌科的促炎细菌，都是菌群失调的标志。因此，随着原发性肝癌的进展，菌群可能会进一步恶化。为了确定哪些细菌种类导致变形杆菌的扩张，研究者接下来在属水平上分析了各组间肠道微菌群的变化。
图1 Shannon-Wiener 指数（A）.Simpson 指数（B）.原发性肝癌患者和健康对照组肠道菌群优势门的相对丰度（C）.
3 原发性肝癌患者的菌群失调程度增加
在属水平上，研究者从86份粪便样本中鉴定出了604个属。其中，以Bacteroides属(39.91±2.01%)为主，其次为Prevotella (6.19±1.36%)、Faecalibacterium (4.83±0.50%)、Ruminococcus (4.07±0.52%)、Parabacteroides (3.79±0.43%)、Fusobacterium (3.58±0.70%)、Escherichia (2.34±0.43%)、Roseburia (2.08±0.26%)、Streptococcus (1.84±0.41%)和Blautia (1.76±0.19%)，前10个属占分析得到的序列的71.75±1.63% (图2 A)。基于非参数Kruskal–Wallis秩和检验，在不同的原发性肝癌患者分期组和健康对照组中，总计有54个属存在显著差异。与健康对照组相比，在I期原发性肝癌患者中Actinomyces, Atopobium, Desulfococcus, Enterobacter, Paraprevotella, Planctomycetes, Prevotella, Veillonella 的丰度升高；Desulfococcus, Enterobacter, Lactococcus, Leptotrichia, Paraprevotella, Planctomycetes, Prevotella, Veillonella 属在II期原发性肝癌患者中丰度升高；Actinomyces, Atopobium, Desulfococcus, Enterobacter, Haemophilus, Lactococcus, Leptotrichia, Neisseria, Oribacterium, Prevotella, Rothia, Selenomonas, Veillonella属在III期原发性肝癌患者中丰度升高(图2 A)。
图2 根据粪便菌群中发现的排名前10的菌属，A.以及不同原发性肝癌患者和健康对照组肠道菌群中发现的显著差异菌属绘制的Circular layout和B.进化分枝图布局。与健康对照组相比，图中圆形的颜色显示了原发性肝癌不同阶段患者肠道菌群在属水平的变化。丰度升高的属包括黄色(I期)、灰色(II期)、淡红色(III期)、粉红色(I期和II期)、红色(I期和III期)、暗红色(II期和III期)和黑色(I期、II期和III期)；丰度降低的属包括鲜绿色(第I期)、绿色(第II期)、蓝色(第III期)、浅绿色(第I期和第II期)、浅蓝(第I期和第III期)、深蓝(第II期和第III期)、深绿色(第I期、第II期和第III期)。
厚壁菌门与拟杆菌门(图3A)，土著菌与非土著菌的丰度比值(图3 B)，肠杆菌科双歧杆菌属(图3C) 发现不同阶段原发性肝癌与健康对照组无显著性差异。然而，该分析方法并不全面。因此本研究建立了一个更为综合的指标，称为菌群失调程度(Ddys)，比较分析原发性肝癌各阶段及健康对照组肠道微生物群的Ddys指数差异。在用于计算Ddys的20个常见肠道细菌属中，本研究未发现一种主要的益生菌属(Oscillibacter)和两种潜在的有害菌属(Akkermansia以及Helicobacter)。与健康对照组相比，原发性肝癌患者的Ddys明显增加。此外，研究者发现，随着原发性肝癌的进展，Ddys指数有增加的趋势，但不同原发性肝癌分期的患者间差异不显著(图3D)。
图3 箱形图显示了菌群失调程度的变化。A. 指标的描述以及如何根据厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度计算这些指标. B. 根据土著菌和非土著菌群的相对丰度. C. 基于双歧杆菌和肠杆菌科的相对丰度. D. 根据7个益生菌属 (Anaerostipes, Bifidobacterium, Coprococcus, Faecalibacterium, Lactobacillus, Oscillibacter, Phascolarctobacterium) 以及13个有害菌属(Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Dorea, Escherichia, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Prevotella, Ruminococcus, Streptococcus, Veillonella)。
4 菌群失调指数Ddys和ALT, TB以及 AST水平的相关性分析
图4A所示，虽然Ddys与ALT水平无显著相关。但Ddys与总胆红素浓度、AST水平呈正相关，而该两个指标通常用于评估肝功能。
图4 Ddys 和 ALT 水平 (A), TB水平 (B) 以及 AST (C)水平的相关性分析. Ddys是根据7个益生菌属(Anaerostipes, Bifidobacterium, Coprococcus, Faecalibacterium, Lactobacillus, Oscillibacter, Phascolarctobacterium) 以及13个有害菌属(Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Dorea, Escherichia, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Prevotella, Ruminococcus, Streptococcus, Veillonella) 计算得到的。
结论
综上所述，本文中，研究者引入菌群失调指数Ddys来评估肝癌患者肠道菌群的失调状况，发现原发性肝癌患者的Ddys指数明显高于健康对照组。此外，Ddys指数随着原发性肝癌的发展呈上升趋势，但不同分期的原发性肝癌患者间差异并不十分显著。然而，由于在原发性肝癌患者中与菌群失调密切相关的细菌属中，Ddys指数持续增加。因此需要进一步的研究来验证该指标在其他疾病中的应用。
评论
近年来，相关研究证实，在人类和啮齿动物模型中，肠道微菌群失调与慢性肝病(chronic liver diseases, CLDs) 密切相关。部分研究报道了不同病因的CLDs与菌群失调有关。例如，慢性肝炎或乙型肝炎感染后肝硬化失代偿期患者的粪便中双歧杆菌和乳酸产生菌的数量减少，而粪肠球菌和肠杆菌科的数量显著高于无症状携带者和健康对照组。此外，利用细菌16S rRNA基因的高通量测序发现，酒精性或乙型肝炎相关肝硬化患者的肠道菌群明显区别于健康对照组。
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)作为一种进展期CLDs，是慢性肝损伤、炎症和纤维化长期作用的结果，是全球癌症相关死亡的第三大主要原因。最近有报道称，肠道菌群失调与HCC密切相关，包括Gemmiger和Parabacteroides，在肝硬化到肝癌的早期HCC中富集。肝细胞癌的发生伴随着菌群的失调，通常会增加体循环中内毒素和其他有害细菌物质，从而进一步增加肝损伤。因此，研究者假设与原发性HCC相关的菌群失调程度随着肿瘤进展阶段的增加而增加，并提示其对HCC患者预后的重要性。
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