编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
原发性硬化性胆管炎（Primarysclerosing cholangitis, PSC）又称狭窄性或闭塞性胆管炎，是一种病因不明的慢性进行性胆汁淤积性肝病，其特征在于肝内外胆管进行性炎症和纤维化，进而导致多灶性胆管狭窄。
本研究旨在两个独立的PSC患者队列中（挪威队列和德国队列）利用宏基因组测序和靶向代谢组学分析，以明确哪些微生物物种的变化与PSC显著相关，以及与PSC发病机理和进展相关的特定微生物代谢功能的变化。本研究对来自两个队列（挪威人和德国人）的粪便DNA样本进行宏基因组测序，其中包括136例PSC患者（58 % 同时患有IBD），158例健康对照和93例无PSC的IBD对照，使用HUMAnN2和MetaPhlAn2进行数据处理，并使用广义线性模型和随机荟萃分析进行分析。研究发现，与健康对照组相比，PSC患者肠道中测得的微生物基因数更少，同时其肠道中微生物的基因功能也具有显著差异，尤其是与必需营养素相关的微生物代谢途径。该研究提示，肠道微生物代谢功能的改变可能与PSC的病理进展有关。
原名：Altered gut microbial metabolism of essential nutrients in primary sclerosing cholangitis
译名：原发性硬化性胆管炎肠道微生物必需营养素的代谢变化
期刊：Gastroenterology
IF：18.187
发表时间：2020.12
通讯作者：Johannes R. Hov
作者单位：挪威奥斯陆大学国家医院PSC研究中心
1 PSC患者和对照组肠道微生物整体分类和遗传多样性
在PSC患者、健康对照和IBD对照组的合并队列（表1）中，三组之间的总体微生物结构具有显著差异（图1A）。同时，对两个队列进行分别比较，菌群整体结构的差异同样明显（图1B和C）。此外，受试者所处的地理环境也是影响肠道总体微生物组成的重要因素之一（图1A）。研究发现，与健康对照组相比，PSC患者的肠道菌群的基因丰富度显著降低（图1D），而且在调整年龄，性别和BMI之后（线性回归，P <.016，P = .001和P <.0001），在两个独立队列和合并队列中，PSC患者菌群的基因丰富度均显著下降，同时PSC患者并发IBD对其菌群的基因丰富度没有显著影响。
表1. 本研究队列中所纳入的PSC患者和对照组的临床基本特征.
图1. PSC患者和对照组肠道中总体细菌分类组成和基因丰度差异. (A)PSC患者、健康对照和IBD对照组在属水平上基于Bray-Curtis距离算法的差异分析，分别在合并的队列和(B)德国和(C)挪威的队列中进行分析，显示整体的微生物群组成变化; (D)与对照组相比，PSC中检测到的细菌基因数量.2 PSC患者与健康对照组的肠道菌群在种水平上的组成差异在本研究中，经过数据质控和过滤后，整个测序数据集从门水平到菌株水平共鉴定出413个分类群。该研究确定了与健康对照组相比，PSC患者肠道中Clostridium asparagiforme和一种未分类的Escherichia显著富集，以及其他几种物种的显着降低，例如Ruminococcus obeum , Eubacterium siraeum , 和Eubacterium rectale（meta-analyses Qfdr<.05，图2A）。此外，该研究发现，与健康对照组相比，PSC患者肠道中5类菌株丰度显著下降（图2B），而Veillonella atypica, Veillonella parvula以及一种未分类的Veillonella则显示出上升趋势。
图2.PSC患者与健康对照组相比肠道菌群在种水平上的组成差异. (A)在PSC和健康对照组中物种的丰度差异和(B)比例差异分析。物种通过门属关系着色; (C)健康对照组和(D) PSC患者中的细菌丰度关联网络分析.3 PSC患者肠道中微生物代谢相关氨基酸和维生素B生物合成途径变化经过数据质控和过滤，该研究在两个队列中均检测到共计121个代谢途径（MetaCyc pathways）和424个酶家族。除106个酶家族外，与健康对照组相比，该研究还确定了PSC患者肠道菌群中有53种代谢途径的丰富具有显著差异（meta-analyses，Qfdr <.05，图3）。其中，与健康对照组相比，PSC患者肠道微生物中与支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）异亮氨酸的生物合成相关的代谢途径显着减少，而上述代谢变化在IBD对照组与PSC患者中则无显著差异。此外，与芳香族氨基酸生物合成有关的代谢途径在两组之间也存在差异，但整体趋势并不一致，例如某些途径在PSC患者中显著富集（如PWY6628，L-苯丙氨酸生物合成途径），而另外某些途径则显著降低（如COMPLETE ARO-PWY，芳香族氨基酸生物合成途径）。与健康对照组相比，在PSC患者肠道中显著富集的7条代谢途径中，有4个与其他两个氨基酸（即精氨酸和鸟氨酸）的生物合成有关。这4个途径在PSC和IBD中的水平相似。与健康对照组相比，PSC患者肠道中与硫胺素（thiamine，维生素B1）生物合成相关的代谢途径水平显著升高（例如，THISYN-PWY硫胺素二磷酸生物合成I的超级途径，图3）。另一方面，生物合成硫胺素（维生素B1）的关键中间体5'-磷酸核糖基-5-氨基咪唑（PWY6122，PWY6277和PWY6121）的三种生物合成途径均在PSC中显著降低。
图3.PSC患者中肠道微生物代谢途径的改变. 热图显示了PSC患者和健康对照组肠道中微生物的代谢途径(Metacyc pathways，Qfdr <.05)在各个队列(热图的左侧)和荟萃分析(热图的右侧).4 PSC患者肠道微生物对支链氨基酸和维生素B相关的代谢变化与健康对照组相比，PSC患者肠道微生物中与BCAAs相关的异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸相关的几种酶家族水平均显著降低（图4A-C）。此外，与健康的对照组相比， PSC患者肠道中与维生素B6代谢相关的几个酶家族具有显著差异，其中最显着的是5-磷酸吡哆醛合酶（pyridoxal-5-phosphate synthase，EC4.3.3.6）（图4D），作为一种5-磷酸吡哆醛生物合成酶II以及从头合成维生素B6活性形式5-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphate，PLP）的主要生物合成途径。与此同时，在PSC患者中，核黄素激酶（EC2.7.1.26）和EC2.7.7.2 FAD合成酶，主要负责维生素B2的活性形式，黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）也显著降低（图4E＆F ）。而主要负责核黄素（riboflavin）和5-amino-6-d-ribitylaminouracil（5-A-RU）合成反应的核黄素合酶（EC2.5.1.9）则在PSC患者中显著升高（图4G）。此外，PSC患者肠道中微生物与氨生成有关的酶家族的丰富也显著增加（图4H＆I）。与健康对照相比，PSC患者肠道中与抗生素抗性相关的酶家族（如EC3.5.2.6 b-内酰胺酶）也显著升高（图4J）。
图4. PSC患者肠道微生物的遗传潜力.点状图显示与支链氨基酸(A)缬氨酸, (B)亮氨酸和(C)异亮氨酸, (D)维生素B6 (pyridoxal5’-phosphate, PLP)的活性形式和(E)维生素B2的活性形式，黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和(F)黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的活性形式, (G)核黄素(维生素B2)的合成和相关代谢产物,(H-I)合成氨和(J)抗生素抗性.5 PSC患者肠道及血浆中菌群相关代谢产物水平显著降低本研究通过靶向代谢组分析发现，与健康对照组相比，PSC患者血浆中维生素B6、PLP和BCAAs中异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的主要活性形式的水平显著降低（图5A-D）。与对照组相比，PSC患者中的其他维生素B6代谢产物（吡哆醛和4-吡啶氧酸）也较低。由于微生物的代谢物可能会改变疾病的进展过程，因此该研究还分析了PSC患者肠道中菌群的代谢物与肝移植生存率之间的关系。此外，将患者血浆中上述代谢物的浓度分为四分位数时，上述低浓度的代谢物均可以较好的预测患者肝移植无病存活率的显著降低（图5E-H）。其中，尤其是血浆中PLP的浓度与患者的肝移植无病存活率关联最为显著（图5A和E），其浓度与Cox回归模型中的肝移植或死亡风险降低显著相关，而与Mayo风险评分及进展性肝纤维化（enhanced liver fibrosis，ELF）评分无关。
图5. 微生物相关的代谢产物与肝移植的无病生存率。(A)与健康对照组相比, PSC患者血浆中的活性维生素B6代谢物(pyridoxal 5’-phosphate, PLP), (B)异亮氨酸, (C)亮氨酸和(D)缬氨酸的浓度变化;Kaplan-Meier分析显示血浆中低浓度的(E)PLP, (F)异亮氨酸，(G)亮氨酸和(H)缬氨酸均与PSC的肝移植无病生存率降低有关。6 微生物组可以预测PSC的疾病表型和患者临床特征接下来，该研究进一步利用队列中菌株水平的测序数据构建随机森林模型，该模型具有较高的预测能力（AUC =0.88±0.04，图6A），可以将PSC患者与健康对照较好的区分开，同时该模型还可以将从PSC患者从IBD中显著的分离出来（AUC = 0.83±0.07）（图6B）。
图6. 随机森林分类法区分PSC患者和对照组的临床表型. (A)PSC患者与健康对照; (B)PSC患者与IBD对照组;使用所有可用微生物物种(红线)或显著差异微生物物种(蓝线)进行区分。
在该研究中，研究者分别分析了来自挪威和德国两个队列中，PSC、IBD对照组和健康对照组的粪便微生物组。在来自挪威的PSC患者和健康对照者的独立队列中，使用高分辨宏基因组测序和靶向代谢组学分析，研究者挖掘出了一个与PSC显著相关的肠道微生物组，具有低细菌丰度和多样性改变，同时不受并发IBD的影响，并且可以在种水平上进行确定。此外，该研究还发现PSC患者肠道微生物组中与维生素B6合成和支链氨基酸合成的相关基因功能发生了显著变化，同时PSC患者血浆中维生素B6和支链氨基酸的浓度也显著降低。同时，上述代谢物的浓度降低还与患者的肝移植无病存活率降低显著相关，该结果表明分析PSC患者肠道中微生物代谢的变化可有助于明确与PSC进展相关的病理改变。
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