科研 | ISME：拟南芥与生活史较长的共生植物根际微生物的比较
编译：Rivc，编辑：小菌菌、江舜尧。
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作为遗传研究的模型，拟南芥（Arabidopsis）具有巨大的潜力，可以揭示与植物基因组相关的，塑造根部微生物组的机制。但是，该物种的逃亡生活史可能已经进化。
为了确定拟南芥的根际效应是否与具有较短逃亡历史的其他植物物种不同，我们将拟南芥的根微生物组与来自同一栖息地的其他八个后来的演替植物物种进行了比较。该研究包括来自田间和实验室的土壤，根际和根际内微生物组进行分子分析。
分子分析显示，根际效应（通过富集和枯竭的细菌类群的数量来量化）比其他八个物种的平均值低约35％。然而，在土壤和根际之间存在大量的微生物分类单元，它们在很大程度上代表了其他植物的根际效应。就真菌类群而言，拟南芥根际差异丰富的类群数量为其他物种平均数量的10％。在通常具有更高选择性的植物根际内，拟南芥的根际效应可与其他物种媲美
论文ID
原名：Quantitative comparison between the rhizosphere effect of Arabidopsis thaliana and co-occurring plant species with a longer life history
译名：拟南芥与生活史较长的共生植物根际效应的定量比较
期刊：The ISME Journal
IF：9.18
发表时间：2020.5
通讯作者：Ton Bisseling
作者单位：瓦赫宁根大学
实验设计
结果
1. 研究地点和实验设置
我们利用了荷兰Veluwe地区的一个古老的田间草地生态系统，该地区的拟南芥生长在已经开放的点上，周围有其他具有不同生活史的植物物种。在这个被称为“ Mossel”的地区，在从耕地向半天然草地的最初过渡以及随后的植物群落继承之后，已经进行了生态研究。这涉及随着时间的流逝对植物物种的丰度进行严格监控（图1a）。在这种二次演替轨迹中，一年生植物被多年生植物取代，土壤群落的各个组成部分之间的联系日益紧密。为了与拟南芥进行比较，我们选择了8种植物物种，分别代表不同种类的分类进化枝（图S1），其中相对丰度在20年的时间内记录下来（图1a）。停止农业耕作后，自停耕以来，一年生田间勿忘我（Myosotis arvensis）和一年两次的光滑（Crepis capillaris）的种群迅速增加，然后随时间减少，而多年生植物如牛眼在继承的前20年中，雏菊（Leucanthemum vulgare）和艾菊（Tanacetum vulgare）逐渐变得更加丰富。对于其他四个物种，丰度模式随时间波动（图1a）。这项长期研究并未记录拟南芥的覆盖率，因为年度测量是在7月完成的，而拟南芥完成其生命周期将近2个月，因此在植被中不再可检测到。虽然拟南芥预计将在土地被遗弃后很快消失，但仍然可以在裸露的土壤上找到这种植物，这些土壤是由挖地鼠如野猪，野兔和较小的生物体（如蚂蚁）产生的，这些土壤将地下土壤带到土壤表面（图S1A）。在2018年春季，我们在Mossel区域的围栏部分的地块上检查了拟南芥的相对面积覆盖率，该区域是实验场。我们发现，拟南芥的植被覆盖度与裸露的土壤百分比之间存在正相关关系（R2 = 0.72，p <0.01；图1b）。拟南芥即使经过20多年的次生演替也仍留在草地系统中，这一事实使得能够将先锋拟南芥与多年生物种（如T. vulgare和L. vulgare）的根际效应进行比较。
在最近进行围栏试验的Mossel围栏部分的试验田上，本地拟南芥登录号Msl 与其他8个本地同时存在的植物种一起生长（图S1C）。种植6周后收获大块土壤，根际和根际。这九种植物产生了不同数量的根际土壤。然而，在所有情况下，鲜根重量与根际土壤重量之比是可比的（图1c）。我们使用HiSeq 2500平台（Illumina）通过16S rDNA扩增子测序分析了细菌群落。我们无法从蒲公英中根际样品中分离出DNA，因此将其排除在进一步分析之外。以≥97％的序列同一性对操作分类单元（OTU）进行聚类，并去除低丰度的OTU，从而产生了一个数据集，该数据集具有超过2500万个读数，分为142个样本和3187个OTU。
2 拟南芥显示出相对较低但显着的细菌根际作用
众所周知，根际效应会导致微生物物种的均匀度和丰富度（α多样性）降低。为了测试拟南芥和其他物种在我们的实验设置中是否存在这种情况，我们计算了土壤样品以及植物根际和内生根样品的香农多样性指数。我们并未发现根际样品中α多样性的大幅度下降（图2a），这与大多数但并非所有关于土壤和根际土壤研究的α多样性的报道相反。所有植物物种的根际内膜都显示出α多样性的显着降低，表明优势细菌物种的增加。最后，使用丰富的植物读物进行宿主基因分型，使用FreeBayes从读物中调用接近100万个SNP，并高质量映射到TAIR10参考基因组。与采样点相关的有几个清晰的植物基因型簇（图2c），与德国西南部的拟南芥（A.thaliana）的林分一致，通常只携带有限数量的基因型。众所周知，宿主基因型可以影响叶片微生物组的组成，但是由于基因型与野生种群中的位点紧密相关，因此这两个变量会混淆，并且需要附加数据才能分离出。
通过计算每个单独样本中主要门的相对丰度，我们进一步探讨了由于根际效应造成的生物分类组成的变化。与已发表的文献一致，我们观察到所有植物物种的根际中都存在变形杆菌。在根际内，Proteobacteria和Actinobacteria都显示出明显的增加，而Aceobacteria则减少了。这些变化表明，在所有研究过的植物物种的根际和根际内，细菌类群都表现出相对富集和枯竭的现象（图2b）。
为了探究植物根际微生物群的差异，我们进行了主坐标分析（PCoA）。在稀疏的OTU表上使用Bray-Curtis相似度测量，沿着前两个主坐标（PCs）绘制土壤和根际样品。这表明在该田间试验中，测试的9种植物物种建立了独特的细菌根际群落（图3a，左图）。根据成对排列分析的结果，差异是显着的与其他植物物种相比，拟南芥根际样品最接近土壤样品。这意味着拟南芥根际中的细菌群落与土壤的差异小于其他八种植物。(图3a）。尽管在第一个PC上的分离和拟南芥根际样品的相应R2值显示出较低的根际效应，但对于所有植物物种，沿第一个PC轴的散装土壤和根际之间的分离方向都相同。这表明在一定程度上以类似的方式建立了根际中的细菌群落。
PCoA分析描述了整个社区级别的差异。接下来，我们调查了这些差异是否也反映在散装土壤和根际样品之间差异丰富（受影响）的OTU数量上。原则上，与土壤（富集或贫化）有显着差异的OTU越多，根际效应越大。我们计算了根际范围和对数倍阈值范围（-6至6，图3b）之间，根际和土壤之间细菌OTU的数量显着不同（根据R中的metatagenomeSeq程序包）。在绝对log2倍变化阈值为2的情况下，我们发现平均有8782个测试的OTU中有350个受到影响。当将绝对log2倍变化的阈值提高到3时，受影响的OTU会强烈下降，这表明大多数受影响的OTU都显示出适度的丰度变化（图3b，虚线）。
图2 Alpha多样性和门级分类学表明了所有植物物种的根际效应。
3 拟南芥对内生细菌具有选择性
检测散装土壤和根际内微生物群之间的差异。所有物种都建立了独特的细菌内根际微生物群，这些微生物群不同于散装土壤（图3a）。沿第一个PC轴（方差的41％），所有根际内样品与散装土壤样品的分离方向相同，而单个物种沿第二个PC轴（方差的9％）分开。由散装土壤和所有单个物种之间成对的PERMANOVA得出的R2值仅在0.74和0.80之间变化（p -FDR <0.01），而拟南芥R2为0.80（图3a）。受影响的OTU数量也反映出土壤和根际样品的强烈分离。在2的log2倍变化阈值下，受影响的OTU的数量从1116到1293（图3c和表S2）。此外，相对于受根际影响的OTU，受影响的OTU的数量以高倍变化下降（图3b，实线）。这表明，根际内细菌的定殖比根际内细菌的定殖要严格得多。拟南芥表现出许多差异丰富的OTU与其他植物物种非常相似（对数2倍变化时为1244，变化2图3c），这表明拟南芥的根际与根际内细菌微生物组中的块状土壤具有可比性。
4 大部分富含植物的细菌OTUs与拟南芥共享
植物可以以植物基因型特异性的方式影响微生物组的组成。但是，它们也共享受影响的OTU。因此，我们研究了拟南芥影响的细菌微生物组在多大程度上包括与其他植物物种的微生物群共有的OTU。这对于评估拟南芥作为模型至关重要，因为它可能是就受影响的OTU而言，拟南芥没有涵盖其他植物物种的球形效应。我们以两种不同的方式进行了分析。首先，我们比较了所有OTU，然后重点研究了8个物种的前10个OTU。在这两种情况下，都针对根际和根际进行。我们确定了每个OTU拟南芥和其他植物物种在土壤和（内-）根际之间的log2倍变化，并使用了成对相关分析。我们认为，显着的相关性和较高的相关系数将表明，一般而言，在拟南芥中受影响的OTU在其他物种中也受到影响。基于log2倍的变化，我们发现拟南芥与其他植物根际之间的相关性很强（平均r = 0.71，p <0.01），并且拟南芥和其他植物根际之间的相关性非常强（平均r = 0.93，p <0.01；表S4）。倍数变化的相关性赋予高和低丰度OTU相似的权重，无论它们是否受到根际效应的影响。为了检查在高度丰富且变化显着的OTU中拟南芥是否也与其他植物种类相似，我们选择了每种植物物种的十个最丰富的高度富集的OTU（“前10个”），并测试了它们是否在拟南芥中富集。八个（非拟南芥）植物物种的根际前10s一起产生了30个富集的OTU，因为许多OTU在物种之间共享。对于每种植物，在拟南芥中富集的10个根际OTU中至少有5个也显着富集（图4，上图）。此外，在全部30个丰富的OTU中，有16个在拟南芥根际中也富集。在这16个中，在拟南芥中十个富集的OTU中也存在五个细菌OTU。
拟南芥和其他植物在根际和根际内还表现出植物物种特异性的富集。接下来，我们研究了植物物种之间的植物特定根际效应是否以及如何不同。为此，我们为每个OTU确定了其丰富的物种（频率）数量，并绘制了每个频率下这些OTU的数量。如图5a，根际中富集的OTU数量随频率增加而减少。唯一（特定于植物的）OTU的数量因植物种类而异，轮叶对虾的丰富OTU数量最少（4个，占根际读数的0.1％；见图5a和表S3），数量最多克氏乳杆菌（L.corniculatus）（77，占根际读数的5.0％）。富含L.corniculatus的OTU的分类学特征再一次不受可编结豆类的类群的支配，当我们将此与其他植物物种的分类学特征进行比较时（表S3）。拟南芥具有15种植物特有的OTU，占根际总读数的1.1％。在所有物种中富集的OTU平均占根际群落的1.7％。在根际内，最初减少后，每个频率的富集OTU数量增加，所有植物物种之间共享的富集OTU数量最高（图5b）。对于拟南芥，有15种特定的富集OTU，总相对丰度为1.1％。在所有植物物种中富集的156个OTU平均代表了根际内球菌群落的38％（表S3），这表明植物根际内普遍存在大量细菌。
图4 拟南芥与大多数高度富含植物的细菌OTU共享。
图5 OTUs只能在一种或多种植物中受到影响。
5 根际和内根际的真菌群落
我们使用类似的测序方法，基于ITS2区域，然后分析了田间实验所有样品的真菌群落。如图6a所示，根际样品从大块土壤中分离出来，但与细菌数据集相反，并非全部沿前两个PC轴都在同一方向上。根据PERMANOVA，我们发现散装土壤和单个根际样品之间的成对比较的R2值有很大的差异（从拟南芥的0.19到角质乳酸杆菌的0.79，p-FDR <0.05）。正如相对较低的R2值所反映的那样，拟南芥真菌根际样品在PCoA中最靠近土壤聚集。
在土壤和根际土壤中的真菌微生物组上的PCoA表明，在群落水平上，包括拟南芥在内的单个物种的根际土壤与散装土壤相比有所不同（图6b）。从成对的R 2值（范围为0.37至0.46（PERMANOVA，p-FDR <0.01；表S1））和受影响的真菌OTU数量（对数2倍2的143至211；表S2）中也可以看出这一点。在比较这9个物种时，拟南芥的R2值（0.43对0.41平均值）和受影响的OTU（172对166平均值）均略高于平均水平，这表明拟南芥的内生根层与散装土壤相当（见图6c）。作为十字花科物种，拟南芥不能与丛枝菌根真菌（AMF）形成共生，而其他植物物种则可以这样做。有趣的是，我们发现对于所有的根际内样品，球状纲门的相对丰度都相当，其中主要包括AMF。
图6 根际对真菌群落的影响
6 室内试验重构了现场实验的发现
为了确定实验室实验是否不同于实地实验，以及是否如此，我们使用PCoA分析了所有样品的细菌群落（图7a）。第一个PC轴解释了36％的方差，并根据隔室（而不是根据现场和实验室实验）分离了样品。沿着第二个PC轴，两个实验是分开的，但是这种分开说明了相对较低的方差（7％）。这表明，基于整个社区，实验室和田间实验中所有隔室的细菌微生物组具有可比性。有趣的是，实验之间的内生根际和根际内的群落之间的差异比起始土壤的差异更大。这表明与植物有关的细菌群落在一定程度上证实了田间试验和实验室试验的不同，并且这些试验中的起始土壤不是造成这种差异的主要决定因素。为了获得更多关于实地研究与实验室研究之间差异的定量见解，我们研究了实地实验中发生变化的OTU是否也发生了变化。为此，我们将现场实验中每个受影响的OTU与实验室实验中的相同OTU进行了比较（图7b）。对于log2倍变化范围，我们计算了在现场实验中受影响的OTU的绝对数量（图7b中），并绘制了在实验室实验中也受影响的分数。尤其是在log2倍变化较高的情况下，大部分受影响的OTU被实验室实验捕获。尤其是在根际内情况下，对数变化为6的log2倍时，在现场实验中几乎所有的OTU也在实验室实验中也发生了变化。这表明尽管PCoA在社区水平上存在细微的差异，但田间和实验室条件下的植物似乎在很大程度上丰富了相同的微生物类群。
图7 根际效应可在室内实验中重建。
图8 拟南芥根际效应定量比较
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