科研 | Gut ：在阿尔茨海默病动物模型中健康微生物群的转移可减少淀粉样蛋白 和tau蛋白病理学

编译：碎碎念，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

阿尔茨海默病(AD)的特点是β-淀粉样蛋白(Aβ)和过度磷酸化的tau蛋白在脑内弥漫性累积以及突触功能障碍。此外，正如AD患者小胶质细胞和星形胶质细胞激活所示，大脑内炎症信号发生了改变。这些特征会引起认知障碍和记忆丧失。虽然阿尔茨海默病的神经病理学特征已得到充分证实，但目前尚无有效的治疗方法能够阻止或延缓阿尔茨海默病的进展。因此，我们需要基于各种病理通路来探索治疗AD的新方法。肠道微生物群被认为是一种被遗忘的调节宿主生理和新陈代谢的因素，且其功能已经延伸到大脑发育和认知功能。在帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症中报道了肠道微生物群可能与神经变性疾病有关。在转基因AD模型和患者的微生物组研究中，我们试图完善AD的发病机理并以不同的方式去表征其病理。在AD小鼠模型和患者中均发现了肠道微生物群的组成和生物多样性的改变。抗生素治疗的APP/PS1小鼠(ABX)和益生菌治疗的3×TgAD小鼠显示出大脑Aβ沉积明显降低以及外周循环细胞因子、趋化因子和肠道激素等模式发生改变。而且，将改变后的微生物群移植到无菌的APP-转基因小鼠中，可表现出相同的Aβ沉积病理特征，这种可传递性表明肠道微生物群在AD早期发挥了作用。但是，目前肠道微生物群的远端效应在AD发病机理的特异性信号介质或者机理尚不清楚。

本研究利用近期开发的转基因AD小鼠模型(ADLP^APT)--具有淀粉样变性和神经纤维结的AD样病理组织（即在大脑中同时具有Aβ和TAU蛋白病体特征），检测了肠道微生物群在AD发病机理中的作用。我们发现肠道微生物群的改变和上皮屏障完整性的缺失在ADLP^APT小鼠的病理条件下诱导发生全身慢性炎症。值得注意的是，从健康的野生型(WT)小鼠中频繁转移和移植粪便微生物组可以减少Aβ斑块和tau分裂的形成，以及ADLP^APT小鼠的记忆缺失和反应性胶质变性。此外，肠道微生物群的改变影响了肠道基因的表达和外周免疫细胞群。研究结果揭示了肠道微生物群在AD发病机制中的重要作用，表明了异常的免疫应答可能是宿主脑和肠道微生物群远距离作用的潜在调节因子。

论文ID

原名：Transferof a healthy microbiota reduces amyloid and tau pathology in an Alzheimer’sdisease animal model

译名：在阿尔茨海默病动物模型中健康微生物群的转移可减少淀粉样蛋白和tau蛋白病理学

期刊：Gut

IF：9.86

发表时间：17.94

通讯作者：Jin-WooBae；Inhee Mook-Jung

作者单位：庆熙大学生命与纳米药物科学系和生物系；首尔国立大学医学院生物化学与生物医学系

实验设计

本研究利用近期开发的转基因AD小鼠模型(ADLPAPT)--具有淀粉样变性和神经纤维结的AD样病理组织（即在大脑中同时具有Aβ和TAU蛋白病体特征），检测了肠道微生物群在AD发病机理中的作用。

结果

1 ADLP^APT小鼠的肠道微生物群在群落水平的改变

    为了检测AD患者脑内神经病理学变化是否与肠道微生物群有关，我们研究了8个月龄ADLP^APT小鼠的肠道微生物群组成，此时开始出现严重的Aβ沉积和tau蛋白。使用454对16S rRNA基因扩增子进行焦磷酸测序，在Bray-Curtis（OTU丰度）和Jaccard（OTU发生）的基础上，通过主坐标分析对WT和ADLP^APT小鼠之间的肠道菌群基于生物分类单位（OTU）进行比较。根据OUT级细菌种类的发生率和丰度（图1A，B），将ADLP^APT小鼠的肠道菌群与WT小鼠出现差异，表明ADLP^APT小鼠肠道微生物群发生改变。

图1AB ADLP^APT小鼠肠道微生物群组成的变化

2 ADLP^APT小鼠模型的慢性低水平肠道和全身炎症以及肠道的高渗透性

为了确定ADLP^APT小鼠肠道菌群改变对肠屏障功能的影响，我们通过异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖方法测量了WT和ADLP^APT小鼠的肠道通透性。我们发现ADLP^APT小鼠的FITC-右旋糖酐血清浓度显着高于WT小鼠，表明ADLP^APT小鼠的肠道通透性增加（图1C）。我们测量了WT和ADLP^APT小鼠的粪便白蛋白水平，但未观察到差异（图1D），这表明ADLP^APT小鼠的高肠通透性可能不归因于细胞损伤。此外，与野生型小鼠相比，ADLP^APT小鼠表现出反映肠道炎症的粪便脂质钙蛋白2浓度高（图1E），这表明ADLP^APT肠存在慢性低度炎症。ADLP^APT小鼠肠屏障完整性的缺失可能使血流从肠腔通过门静脉流向周围器官。在这方面，我们测量了血清脂多糖结合蛋白（LBP）的水平，作为引起系统性炎症的微生物群衍生化合物进行系统性传播的标志。我们发现ADLP^APT小鼠的血清LBP水平高于WT小鼠（图1F），表明可能是全身性炎症由肠道微生物群来源的抗原（包括脂多糖（LPS））流入ADLP^APT小鼠的循环系统引起的。总之，以上结果证明来自ADLP^APT小鼠肠道微生物群改变的微生物成分（例如LPS）可能通过可渗透的肠道屏障促进了AD发病。

图1C-F ADLP^APT小鼠高肠道通透性以及肠道和全身炎症

3 粪便微生物群的频繁转移减轻了ADLP^APT小鼠的认知障碍，Aβ斑块负担，tau病理和反应性神经胶质的活性

为了阐明肠道菌群改变对AD发病机制的影响，我们几乎每天将WT小鼠的粪便材料转移至ADLP^APT小鼠，共持续4个月（FMT）（图2A）。FMT在很大程度上影响了ADLP^APT小鼠的肠道菌群。FMT小鼠（4个月大的小鼠）2个月后，肠道微生物群落组成发生了显着变化；最后，它与FMT 4个月后（6个月大的小鼠）的WT和ADLP^APT小鼠的菌群相似。我们进行了两项行为测试，以评估空间学习和记忆功能。在Y迷宫中，与ADLP^APT小鼠相比，FMT小鼠的空间短期记忆障碍得到了明显缓解，总体无显著差异（图2B，C）。接下来，我们在情境恐惧条件分析中评估了FMT小鼠。恐惧条件测试中的所有组在足部电击后均表现出相似的冻结行为（图2D–G），而FMT小鼠在情境测试中表现出长期记忆障碍改善的趋势（图2E，H）。这些数据表明，持续暴露于健康的肠道菌群可能会改善ADLP^APT小鼠的认知功能受损。

图2 FMT后ADLP^APT小鼠的记忆缺陷得到改善

为了确定健康的肠道菌群对Aβ斑块沉积的影响，我们检测了ADLP^APT小鼠的Aβ斑块负担。与ADLP^APT小鼠相比，FMT小鼠的额叶皮层（图3A，B）和海马（图3G，H）的总斑块面积明显较小。此外，ELISA分析表明，与ADLP^APT小鼠相比，FMT小鼠的大脑皮层中可溶和不可溶Aβ40水平均显着降低（图3C，D）。此外，FMT小鼠表现出改善Aβ42聚集的趋势（图3E，F）。

图3 FMT后ADLP^APT小鼠的Aβ斑块负担降低

接下来，我们发现FMT诱导的肠道菌群变化降低了ADLP^APT小鼠海马中的病理性tau聚集体（图4A，B）。使用AT180（Thr231位点的高磷酸化代表tau病理的早期事件）和AT8（Ser202/ Thr205位点的高磷酸化代表tau病理的中期或晚期）抗体，我们发现在FMT后的ADLP^APT小鼠中检测到成对的螺旋状丝状tau螺旋AT180和AT8均显着降低（图4C–F）。这些结果表明，暴露于健康的肠道菌群可以削弱大脑中的Aβ沉积和tau病理。

图4 FMT后ADLP^APT小鼠海马中tau的聚集减少

由于中枢神经系统（CNS）的神经胶质增生是AD公认的病理特征，因此我们用离子化钙结合适配器分子（Iba1）染色鉴定了活化小胶质细胞和用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色的肥大反应性星形胶质细胞。与ADLP^APT小鼠相比，FMT小鼠额叶皮层中Iba1阳性的小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞（图5A–C）显着减少，表明神经胶质沉着症通过移植健康肠道菌群而减弱，进而可能降低ADLP^APT小鼠大脑中的免疫病理反应。

图5 FMT后抑制ADLP^APT小鼠小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生

4 微生物菌群移植改善了ABX治疗的ADLP^APT小鼠的行为障碍，Aβ斑块负担，tau病理和神经胶质活化

为了进一步阐明微生物群可以抑制AD的病理学进展，我们将WT或ADLP^APT小鼠的粪便微生物群移植到接受了五种ABX预处理的受体ADLP^APT小鼠中。首先，我们确认ABX有效抑制了微生物活性，但是未观察到Aβ斑块沉积，tau结节形成和神经胶质变性等变化。WT小鼠粪便微生物菌群的移植改变了ABX处理的ADLP^APT小鼠的肠道菌群的组成。将两组接受ABX处理的ADLP^APT小鼠的肠道菌群与供体小鼠的肠道菌群相互分离出来。有趣的是，与WT微生物菌群移植的ABX处理的ADLP^APT小鼠相比，经ADLP^APT菌群移植的ABX处理的ADLP^APT小鼠表现出更高的肠道通透性。WT菌群的移植改善了ABX治疗的ADLP^APT小鼠的多动症。

接下来，我们测试了粪便微生物群移植是否会影响大脑中的AD发病机理。供体ADLP^APT小鼠和经ADLP^APT微生物菌群移植的ABX治疗的ADLP^APT小鼠显示出相似程度的Aβ斑块，而WT微生物群移植延缓了Aβ斑块在ABX处理的ADLP^APT小鼠额叶皮层中的沉积。WT微生物群移植后，在ABX处理的ADLP^APT小鼠中观察到AT180检测到的tau降低和AT8检测到tau有降低趋势，但未在ADLP^APT菌群移植后的小鼠中观察到该现象。此外，在接受WT或ADLP^APT菌群的ABX治疗的ADLP^APT小鼠之间观察到了神经胶质细胞的差异。结合ABX处理的ADLP^APT小鼠的结果表明，重建健康的肠道菌群可以缓解ADLP^APT小鼠的肠屏障完整性和大脑内AD病变。

5  FMT逆转ADLP^APT小鼠中与组织变性和肠道巨噬细胞活性相关的结肠转录变化

为了阐明ADLP^APT小鼠中FMT诱导的AD相关病理学逆转的肠道相关机制，我们对6个月大的WT、ADLP^APT和FMT小鼠的结肠组织进行了RNA-Seq分析。因此，获得了每只小鼠3.1±0.3Gb（平均值±SD）的高质量读数，产生了19257±115个基因分配。通过对结肠转录组数据的差异表达分析，如果基因表达水平显著高于野生型小鼠，则认为其在ADLP^APT小鼠中表达上调。如果基因表达水平显著低于野生型小鼠，则认为ADLP^APT小鼠中的基因被下调（在线补充图10A，B）。因此，与WT小鼠相比，我们在ADLP^APT小鼠中发现了78个上调基因和136个下调基因（图6A），表明ADLP^APT小鼠的结肠转录组发生了改变。为了弄清楚FMT处理如何影响ADLP^APT的结肠转录组，我们通过比较FMT小鼠和WT小鼠的基因表达水平来跟踪上调和下调基因的变化。在ADLP^APT小鼠中上调的78个基因中，我们发现FMT小鼠中60个基因的表达没有显著差异。对于136个下调的基因，有83个基因在ADLP^APT和FMT小鼠之间没有显著差异（图6B），这表明大多数表达水平改变的结肠基因已被FMT归一化。根据差异（DE）基因的表达水平，FMT小鼠更接近WT小鼠（图6C）。

通过基因本体分析，我们发现ADLP^APT小鼠的DE基因改变与衰老相关的组织变性和粘膜免疫力下降有关（图6D）。具体而言，在ADLP^APT小鼠中上调的基因有助于降低细胞增殖，细胞衰老和细胞生长停滞，这是与衰老相关的典型特征。ADLP^APT小鼠线粒体和核糖体活性相关基因的下调可能导致ATP合成和蛋白质合成异常，这被认为是衰老和神经退行性疾病的关键特征。此外，ADLP^APT小鼠显示出与粘膜免疫反应有关的基因下调。其中与肠道巨噬细胞活性和单核细胞-巨噬细胞轴有关。在肠中，通过循环血液Ly6Chi单核细胞不断补充的肠巨噬细胞有助于肠道稳态，包括组织稳态。因此，对结肠转录组的比较分析表明，FMT可逆转ADLP^APT小鼠的肠道相关异常，例如衰老引起的组织变性和巨噬细胞介导的免疫功能障碍。

图6 FMT后ADLP^APT小鼠结肠基因表达改变的逆转

6 FMT将ADLP^APT小鼠中Ly6G-Ly6C + CD115 +骨髓细胞的超大种群恢复到WT水平

    为了确定与FMT感染ADLP^APT小鼠的AD病理学相关的血液免疫细胞群，我们比较了WT，ADLP^APT和FMT小鼠外周血白细胞（PBL）的概况。因为结肠转录组数据显示与肠巨噬细胞相关的基因表达改变，所以我们集中研究CD11c-CD11b⁺髓样细胞的变化。在流式细胞仪分析中，根据疾病严重程度的变化，检测到CD11c-CD11b⁺Ly6G-Ly6C⁺CD115⁺炎性单核细胞的部分变化。实际上，在ADLP^APT小鼠的PBL中，炎性单核细胞的比例（平均为63.87％）显著高于WT小鼠（平均为42.28％）或FMT小鼠（平均为39.94％）（图7A，B），提示炎症性单核细胞与ADLP^APT小鼠的疾病严重程度成正相关。以上数据表明肠道菌群相关的信号可能参与ADLP^APT小鼠大脑中的AD发病，其中循环的炎性单核细胞可以促进细胞介导。

图7 FMT诱导外周免疫细胞群的改变

讨论

本研究旨在探究肠道微生物群对AD发病机制的潜在影响。结果表明，在ADLP^APT小鼠生命早期，肠道菌群组成的改变会引起慢性肠道炎症和上皮完整性的缺失，从而导致全身性炎症。这些肠道异常表现与ADLP^APT小鼠的Aβ沉积、tau病理、反应性神经胶质增生和认知障碍同时发生，且似乎与单核细胞募集和肠道巨噬细胞功能障碍密切相关。值得注意的是，ADLP^APT小鼠以上病理特征可以通过正常微生物群的频繁转移或者移植来有效改善。因此，我们的发现支持肠-脑双向交流影响AD神经病理学进展的观点。

在ADLP^APT小鼠和WT小鼠生命早期（在2个月大时），其肠道菌群组成就开始出现差异，这种差异在老年小鼠中愈加明显，这表明肠道菌群的改变可归因于转基因修饰。AD转基因诱导的微生物群变化未达到全科或门类水平的变化，在ADLP^APT小鼠中几乎没有检测到特异性的细菌分类。以上结果表明，肠-脑轴的复杂信号级联虽对肠道微生物群有一定影响，但不是决定性因素。这些也指出了菌群生态学，微生物-微生物相互作用或微生物功能对AD发病的重要性（而不是单一细菌分类群的重要性）。值得注意的是，FMT似乎可以改善ADLP^APT小鼠的淀粉样变性，tau病理，反应性神经胶质增生和认知障碍。Minter等人使用ABX混合物抑制APP/PS1小鼠的微生物活性，而Bonfili等人在3xTg AD小鼠中测试了益生菌混合物。最近，Sun等人将野生型小鼠的粪便处理成APP/PS1小鼠。尽管如此，在数只AD模型小鼠中对肠道菌群进行不同干预对其病理生理特征具有相似的影响，这至少表明肠道微生物失衡可以促进AD。

ADLP^APT小鼠的结肠基因表达模式也不同于WT小鼠，其中许多基因参与单核细胞趋化性和巨噬细胞激活的炎症反应。已发现，定植在肠道的巨噬细胞对于启动微生物监测的免疫反应至关重要,并在清除凋亡或衰老细胞以及上皮完整性和功能上起着主要作用。随着循环的Ly6Chi单核细胞局部成熟进入肠道，巨噬细胞，单核细胞的补充（例如CC基序趋化因子配体2–CC趋化因子受体2（CCL2–CCR2轴））是维持肠道巨噬细胞的重要过程。因此与趋化因子介导的单核细胞募集有关的基因的下调可能导致单核细胞的补充不完全，从而导致ADLP^APT小鼠肠道巨噬细胞不足。在这方面，干扰素-γ信号的下调和巨噬细胞活化的细胞外信号调节的激酶信号通路可能归因于ADLP^APT小鼠肠道免疫和上皮稳态的干扰。有趣的是，大多数ADLP^APT小鼠特异性改变的DE基因通过FMT恢复至几乎正常表达；这些巨噬细胞介导的变化可能进一步通过循环Ly6C +单核细胞抑制ADLP^APT小鼠的脑淀粉样变性，tau病理，反应性神经胶质增生和认知缺陷。

这些与肠道相关的变化可能共同导致ADLP^APT小鼠肠屏障通透性的增加和肠道慢性炎症，这些被认为是AD的潜在危险因素。为了确定Aβ相关和tau相关神经变性对肠屏障功能的不同贡献，我们还分别评估了仅表达Aβ病理（ADLP^APT/ PS1小鼠）或tau病理（ADLPTau小鼠）ADLP小鼠的肠道通透性。已在老年人、高龄小鼠和果蝇中观察到微生物群相关的肠屏障功能障碍，并被认为是与衰老相关的慢性低度全身性炎症的触发因素。根据结肠转录组数据和粪便白蛋白水平，ADLP^APT小鼠的肠屏障功能障碍的特征可能是上皮细胞衰老和巨噬细胞介导的屏障完整性功能障碍，而不是肠道肠上皮层细胞受损。这些发现与Thevaranjan等人的结果相似，表明老年小鼠的肠道渗漏是由于细胞旁通透性引起的。此外，肠道免疫反应本身的持续异常会触发微生物失衡，从而导致慢性炎症的恶性循环。鉴于肠道通透性先于全身性炎症，微生物源性化合物从肠道向血液循环的转移是全身性炎症的强大驱动力，随后会随年龄的增长而介导组织损伤。实际上，ADLP^APT小鼠表现出较高的血清LBP浓度，FMT使炎症性单核细胞水平恢复至与WT小鼠接近，这提示ADLP^APT小鼠全身暴露于肠道相关细菌内毒素，如LPS。考虑到循环中的微生物内毒素通过诱导单核细胞从骨髓中迁移而增加了循环中的单核细胞，ADLP^APT小鼠的代谢性内毒素血症可能为Ly6C⁺炎性单核细胞循环进入血液提供了机会。外周炎性单核细胞的增加可通过直接渗透到大脑或向大脑产生信号分子来影响AD发病。因此，AD中循环单核细胞在大脑中的作用仍有待进一步研究。

肠道通透性高会破坏血脑屏障，而中枢神经系统很容易暴露于改变的肠道菌群中。在AD患者脑内发现的LPS参与AD病理。LPS和Aβ肽的体外孵育可增强Aβ的原纤维形成，细菌LPS的体内注射会导致WT小鼠和转基因AD小鼠模型出现认知缺陷，并在海马中形成Aβ沉积物和tau聚集。另外，在AD患者的死后脑组织中观察到LPS与Aβ斑块共定位。考虑到已经描述了Aβ表达对脑部微生物感染具有抗微生物活性，因此可渗透的肠屏障和随后的全身炎症可能是ADLP^APT小鼠中Aβ斑块负担的原因。根据最近的研究揭示，5xFAD小鼠在小胶质细胞的耐受期失去了吞噬功能，预期微生物源性代谢产物和/或细菌的慢性转移进入循环会导致ADLP^APT小鼠小胶质细胞的代谢缺陷。

最近，FMT在诸如艰难梭菌感染，IBD和自闭症等疾病的治疗方面受到了广泛关注。在这项研究中，我们首先检查了FMT对AD小鼠模型中Aβ和tau病理的影响。值得注意的是，用健康的肠道菌群替代菌群可以减轻大脑中的Aβ，tau和反应性神经胶质病理（图7C）。因此，我们提出AD中异常的全身性因素可能是该疾病的新治疗靶标，调控包括微生物群的外围系统可以为AD发病机理提供新观点。

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