Journal Club | 20201123期：单细胞分析揭示结肠癌髓系靶向治疗机制
免疫检查点阻断（ICB）可以破坏肿瘤细胞的免疫逃逸而广泛用于肿瘤免疫治疗，但是其只在特定肿瘤的一小部分人群中有作用，因此，有人提出了其他免疫治疗策略，包括清除免疫微环境中的促肿瘤生成细胞和免疫抑制性细胞，并激活特定的免疫细胞亚群。然而，目前我们对肿瘤微环境的复杂性理解的还不够。
单细胞测序是研究肿瘤微环境中免疫细胞亚群的有力工具，不仅可以分析不同T细胞亚群的异质性，还能够通过转录组结合TCR组分析不同亚群间的动态关系。BHLHE40+ Th1样细胞亚群在具有高微卫星不稳定性（high MSI）的结直肠癌（CRC）患者中有富集，而high MSI的CRC患者对ICB反应较好，暗示提高BHLHE40+ Th1样细胞亚群有利于ICB治疗。
近期，单细胞测序揭示肿瘤浸润的髓系细胞的复杂性，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和肿瘤相关DC。TAM是一类具有异质性的细胞亚群，具有促肿瘤作用，而用来抑制TAM的anti-CSF1R免疫治疗在临床上疗效甚微。肿瘤相关DC中的cDC可分为cDC1和cDC2两群，cDC1可以向CD8+ T细胞交叉递呈抗原，因此对于抗肿瘤免疫很重要；cDC2的功能尚未知。而目前临床尝试通过激活DC功能促进抗肿瘤免疫，如anti-CD40，但是单独作用也效果甚微。因此，全面理解肿瘤浸润髓系细胞的复杂性及这些治疗对其中各细胞亚群的影响很重要。
2020年4月，北京大学张泽民教授课题组与合作者在国际顶级学术期刊《Cell》上发表了题为＂Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer＂的文章，利用单细胞转录组测序技术对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群首次进行了系统性的刻画，同时利用小鼠模型，对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理给出了解释。
在该项研究中，研究人员首先使用10x及Smart-seq2两种技术对从结直肠癌患者中收集的免疫和非免疫细胞进行单细胞转录组测序，并从中发现肿瘤相关巨噬细胞可以被分为SPP1 +TAM和C1QC + TAM两个具有不同发育来源、不同细胞功能和不同细胞间相互作用关系的细胞类群。其中，C1QC + TAM可能通过IL1B +的巨噬细胞发育而来，主要与多种T细胞亚群发生相互作用，发挥细胞吞噬和抗原呈递的功能；而SPP1 + TAM则可能由NLRP3 +的组织驻留巨噬细胞发育而来，主要与肿瘤相关成纤维细胞（CAF）发生相互作用，发挥促血管生成及促进肿瘤转移的功能。值得注意的是，结合肠炎病人及健康受试者的单细胞转录组数据，研究人员首次发现，SPP1 + TAM特异性地富集在结直肠癌病人癌组织中，提示在结直肠癌肿瘤发生发展中的重要作用。
基于以上针对结直肠癌病人肿瘤微环境的解析，研究人员接着利用小鼠肿瘤模型来研究靶向不同髓系细胞类群对抗肿瘤免疫反应造成的影响。研究者分别在MC38和Renca两种小鼠模型中进行了anti-CD40与anti-CSF1R的治疗，并获得小鼠肿瘤浸润免疫细胞单细胞转录组图谱。与以上结直肠癌病人相比，DC和T细胞亚群在人和小鼠肿瘤中均有较高的一致性。而尽管巨噬细胞在人鼠间的异质性高于其他免疫细胞类群，但在小鼠肿瘤中也存在着SPP1 + TAM和C1QC + TAM的相似巨噬细胞亚群。
通过对治疗前后各细胞亚群比例及转录组的变化进行分析，研究人员发现anti-CSF1R阻断型抗体会影响处在细胞周期中的巨噬细胞的增殖，并会特异性地删除掉一定比例的具有C1QC +TAM特征的巨噬细胞，却不会对具有SPP1 + TAM特征的巨噬细胞起到作用，提示anti-CSF1R治疗后保留了在肿瘤中具有促进肿瘤血管生成功能的巨噬细胞。
Anti-CD40激动剂治疗可以使MC38小鼠的肿瘤体积缩小，且在与PD1阻断剂联合使用后还可以进一步抑制肿瘤的生长。本研究发现，使用anti-CD40激动剂对MC38小鼠进行治疗后的第2天，激活态的Ccl22 + cDC1细胞即迅速做出响应，细胞比例显著增加。同时，在人鼠间保守的Bhlhe40 + Th1细胞比例也显著上升。使用研究组此前开发的针对T细胞及其克隆性的分析方法STARTRAC，研究人员发现anti-CD40激动剂治疗后，Bhlhe40 + Th1细胞的克隆增生显著增强。相比CD4+ T细胞，CD8+ T细胞的响应速度则较慢，仅在治疗后的第10天，可以观察到Ccl5 + Tem细胞和Cxcr6 + Trm细胞比例的显著增加，值得注意的是，Tem细胞在淋巴结和肿瘤间的迁移能力，及该群细胞与Trm细胞间的转换能力也在治疗后有着显著的提升，提示此群Tem细胞可能与stem-like T细胞相似，具有补充池（Pool）的功能。
此前研究中发现MSI结直肠癌病人中会富集一群BHLHE40 + Th1-like细胞，认为可能是该类型患者免疫治疗响应更好的原因之一。而对于MSS病人的治疗响应仍缺乏认识。在此项结合人鼠单细胞转录组的工作中，团队首次发现靶向DC的治疗策略ani-CD40可以显著地提高此类细胞的水平，为MSS病人的临床治疗策略提供一定的指导。而对SPP1 + TAM细胞的发现和功能分析，以及对靶向TAM的药物机制的研究，将大大有助于后续靶点的挖掘及新的治疗策略的开发。
【总结】
通过单细胞转录组、免疫组测序等技术，对CRC患者的肿瘤微环境进行细胞分群、基因差异表达、细胞发育轨迹、细胞间相互作用等多水平、多维度的详细表征，发现了肿瘤浸润髓系细胞类群中两类特殊的细胞类群TAM和cDC可能在CRC的抗肿瘤T细胞应答、肿瘤发生等过程起调节作用。然后利用小鼠模型，将上述发现应用于对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略的潜在作用机理的解释中。
【原文链接】
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32302573/
Lei Zhang, Ziyi Li, Katarzyna M. Skrzypczynska, Qiao Fang, Wei Zhang, Sarah A. O’Brien, Yao He, Lynn Wang, Qiming Zhang, Aeryon Kim,Ranran Gao, Jessica Orf, Tao Wang, Deepali Sawant, Jiajinlong Kang, Dev Bhatt, Daniel Lu, Chi-Ming Li, Aaron S. Rapaport, Kristy Perez, Yingjiang Ye, Shan Wang, Xueda Hu, Xianwen Ren, Wenjun Ouyang, Zhanlong Shen, Jackson G. Egen, Zemin Zhang, Xin Yu. Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer[J]. Cell,2020,181(2).