中性粒细胞捕获网（NETs)在恶性肿瘤进展中的作用
中性粒细胞是宿主血液中最为丰富的免疫细胞类型，是抵御许多病原体入侵的第一道防线。然而，中性粒细胞在宿主免疫中表现为一把“双刃剑”的作用：一方面，缺乏中性粒细胞的患者容易遭受严重的免疫抑制，通常死于细菌或真菌感染；另一方面，中性粒细胞过度或不成比例的活化可以导致大量的活性氧释放，可直接或间接损伤内皮细胞，导致细胞死亡。2004 年，中性粒细捕获网（Neutrophil extracellular traps, NETs）这一现象被Science杂志首次报道。其形成过程为活化的中性粒细胞通过向细胞外释放去聚化的染色质，形成网状结构。NETs最初的作用被描述为中性粒细胞诱捕和杀死细菌和真菌的一种免疫方式，但近年来的诸多研究表明中性粒细胞的活化失调导致过度产生的中性粒细胞捕获网与许多疾病的进展呈正相关，如血栓形成、伤口愈合延迟、自身免疫性疾病、以及心肌梗死后的缺血-再灌注损伤，此外，关于中性粒细胞捕获网在肿瘤进展中的作用正日益成为新的研究热点，Erpenbeck等在《Oncogene》杂志发表题为《Neutrophil extracellular traps: protagonists of cancer progression?》的综述现介绍如下。
1. NETosis的形成机制
最初，NETs的形成被认为是一种不同于细胞坏死与细胞凋亡的新型的细胞死亡方式，有诸多的刺激物可以促进NETs的形成，如活化的血小板、佛波酯（PMA）、脂多糖、病原菌等。NETs的形成有其独特的方式，是一系列细胞事件精细调控的结果，被称为NETosis。首先，在外界各种刺激下，中性粒细胞活化导致细胞质颗粒及核膜的溶解，中性粒细胞细胞核失去分叶状结构。随后，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）、PAD4等进核内，在中性粒细胞核内协调组蛋白高聚亚氨酸化及染色质去皱，促成细胞质与细胞核含量内容物的融合。最后，随着中性粒细胞细胞膜破裂，核酸和蛋白混合物释放到胞外形成以核酸为骨架附着大量颗粒蛋白的NETs。
Figure1. NETs的形成过程
2. 中性粒细胞与肿瘤
中性粒细胞存在于许多实体肿瘤的周围，连同巨噬细胞和NK细胞，可构成多达80%的肿瘤浸润免疫细胞。目前，对于肿瘤相关中性粒细胞是否与肿瘤患者的预后相关，或者说肿瘤相关中性粒细胞是否是肿瘤进展中的不利因素仍存在争议。这种争议的产生是由于肿瘤相关中性粒细胞存在两种不同的亚型，肿瘤微环境似乎决定了肿瘤相关中性粒细胞的极化状态。肿瘤发生的早期阶段，在不同细胞因子的作用下，肿瘤内中性粒细胞显示出抗肿瘤表型( N1 型) ，其通过分泌细胞因子( IL-1β、TNF-α、IL-6和 IL-12 等) 和免疫活化作用，非特异性的杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的发生和发展。如果在肿瘤早期使用抗 LY6G 的单克隆抗体清除肿瘤微环境中性粒细胞，可促进肿瘤细胞生长，抗体介导肿瘤免疫治疗的疗效显著降低。随着肿瘤进展，在肿瘤发生的中晚期阶段，中性粒细胞聚集于肿瘤基质，在肿瘤微环境细胞产生的生长因子作用下，发生表型和功能的改变，表现为促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成。TGF-β通过上调精氨酸酶 1 （Arginase1, ARG1）、趋化因子配体 2（CCL2）、趋化因子配体 5（CCL5）等表达，抑制其杀伤肿瘤细胞的效应，可以诱导肿瘤微环境中抗肿瘤的 N1 型中性粒细胞向 N2型极化，促进肿瘤生长及转移。NETs的发现也存在同样的问题，即NETs是否也可归为N1或N2类别。这也再次表明，中性粒细胞对肿瘤的发展是一个极其复杂的相互作用过程，远远超出了上述N1和N2表型的理论框架，并且NETs在促进或抑制肿瘤方面是否会因肿瘤微环境、肿瘤种类的不同而不同仍有待研究。
Figure 2. 肿瘤细胞、中性粒细胞、中性粒细胞捕获网之间的相互作用
肿瘤细胞可以招募和激活中性粒细胞，但中性粒细胞的N1激活状态可使中性粒细胞获得抗肿瘤的性质，但NETs释放了一些与肿瘤生长和进展相关的细胞毒性物质及抗菌物质，最终在三者的相互作用之下影响肿瘤的生长、进展、血管生成、肿瘤转移及肿瘤相关栓子的形成
3. NETs在肿瘤生长及进展中的作用
NETs在肿瘤中的作用在2013年被首次提出，此研究是基于小样本量的尤文氏肉瘤样标本。研究结果表明，在肿瘤样本中表达NETs的患者的预后较差，其他几项临床研究也将肿瘤相关中性粒细胞与肿瘤细胞存活、迁移和不良预后联系起来，但没有一项特异性大样本量的研究专注与肿瘤相关的NETs与肿瘤预后的关系。
关于NETs成分与肿瘤进展的关系的研究多基于中性粒细胞蛋白，这些蛋白也是NETs的重要组成成分。NETs被中性粒细胞的原生细胞蛋白（NE、MPO等）以及次生细胞蛋白（pentraxin 3、MMP9）等包裹修饰形成NETs局部微环境，NETs 局部微环境中的高浓度抗菌肽有利于病原体清除。研究证实，MMP-9 可以直接促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进血管生成，并可以通过降解细胞外基质，促进肿瘤细胞远处转移等；NE 具有直接促进肿瘤细胞增殖和远处转移的作用。因此可以推测，NETs 捕获循环肿瘤细胞，使肿瘤细胞暴露于一个活性蛋白丰富的局部微环境中，有利于肿瘤细胞的增殖、远处转移和血管生成，同时还可抑制细胞凋亡。
Figure 3. NETs可以通过多种方式影响肿瘤的生长和进展
通过释放中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）促进肿瘤的生长和迁移，在促进肿瘤血管形成方面，可通过IL-8直接刺激，也可以通过MMP9触发的细胞外基质释放血管内皮生长因子刺激，此外NETs本身可以导致更多的中性粒细胞招募至肿瘤细胞周围，加重炎症反应。
4. NETs在肿瘤相关性血栓中的作用
NETs可以通过多种途径导致肿瘤患者血管内血栓前状态以及血栓形成。NETs作为大分子复合物，可以为血栓形成提供网状支架结构，继而引起血小板粘附、聚集，并募集红细胞、并促进纤维蛋白沉积。而且，NETs的多种组分，包括核 DNA、组蛋白和蛋白酶都有促凝活性。体外实验证实，细胞外 DNA 可以提高蛋白酶促凝活性。组蛋白具有内皮细胞毒性，参与弥漫性微血栓形成、纤维蛋白和血小板沉积，并通过抑制血栓调节蛋白，抑制血浆抗凝血活性，促进血小板聚集。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）可以通过抑制组织因子途径抑制物，增强凝血酶活性，继而促进纤维蛋白沉积。NETs 与肿瘤相关性血栓形成存在密切关系。在多种不同类型的恶性肿瘤中，均存在血浆游离 DNA 升高以及循环 NETs 增多，并且与自发性血栓形成密切相关。荷瘤小鼠体内注射内毒素可以诱导 NETs 形成，进而诱发血栓前状态以及凝血功能障碍。对荷瘤小鼠的外周中性粒细胞进行分析，证实其组蛋白瓜氨酸化水平较高，而且与正常中性粒细胞相比，更容易形成 NETs；通过 DNaseI消化预处理，可以防止荷瘤小鼠注射内毒素所导致的 NETs 形成及肺部血栓发生。发生 NETs 的中性粒细胞中存在 PAD4 高度表达，PAD4 表达水平和瓜氨酸化组蛋白水平可以反映体内 NETs 水平高低。肿瘤相关性血栓形成，通常伴随循环高瓜氨酸化中性粒细胞计数增多，以及血浆组蛋白高瓜氨酸化。与肿瘤相关的血栓性微血管病患者血浆中的高瓜氨酸化组蛋白水平明显升高，而在健康对照组则无此现象。因此，循环高瓜氨酸化中性粒细胞计数，以及血浆高瓜氨酸化组蛋白水平，均可以作为血栓前状态及肿瘤相关性血栓形成的生物标志物，评估肿瘤患者中自发性血栓的形成倾向。然而，使用 NETs 预测肿瘤相关性血栓形成的敏感性和特异性评价以及临界值确定，仍需要进一步大样本的临床研究。
Figure4. NETs促进肿瘤相关血栓的形成
肿瘤细胞刺激中性粒细胞释放NETs，中性粒细胞通过释放中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）等促进血栓前体的形成，并通过VWF附着在血管壁上充当骨架支撑，最终形成血栓
“论肿道麻”点评
中性粒细胞捕获网（NETs)首次被发现时，其主要的功能就是捕获和杀死病原菌。近来研究表明，NETs在抗病毒感染、全身性炎症反应、自身免疫性疾病、血栓形成及肿瘤转移方面发挥作用，尤其是近几年，越来越多的研究表明NET参与肿瘤的转移，肿瘤切除手术之后患者的血液中可检出NETs，而且NETs的丰度越大，肿瘤复发的风险就越高。细菌感染导致的宿主炎症状态会促进肿瘤的复发和转移，NETs诱发的肿瘤个体外周器官的炎症状态也可能是导致肿瘤转移的一个重要因素。中性粒细胞及其代谢产物在肿瘤免疫中发挥的作用正日益引起关注，其抗肿瘤进展的N1亚型及促进肿瘤进展的N2亚型是否存在阈值平衡点仍有待进一步研究。2019年2月Nature杂志刊发瑞士巴塞尔大学的研究报告，通过单细胞RNA测序等技术阐述了肿瘤细胞与免疫细胞（中性粒细胞）之间互作关系，证明了中性粒细胞与循环肿瘤细胞（CTCs）之间的相互作用，中性粒细胞在肿瘤的血行转移中促进了CTCs细胞周期的进展，从而增强了循环肿瘤细胞的转移潜能。同期Nature杂志邀请美国冷泉港实验室的Mikala Egeblad教授撰写述评《Sticking together helps cancer to spread》。该述评认为，在循环肿瘤细胞血行播散的过程中，中性粒细胞与循环肿瘤细胞相互勾结，促进血行播散的发生，拓展了对于免疫细胞如何影响肿瘤细胞转移的新认识。但对于中性粒细胞直接结合循环肿瘤细胞并加速转移灶的形成的具体机制仍有待进一步研究。
（编译 张浩；审校 缪长虹）
参考文献：
Erpenbeck L, Sch?n MP. Neutrophil extracellular traps: protagonists of cancer progression? Oncogene. 2017 May 4;36(18):2483-2490.