易基因 | 文献解读：单细胞RRBS+RNA测序揭示黄曲霉毒素B1诱导S期阻滞L02细胞肝毒性新机制
文献解读：单细胞RRBS+RNA测序揭示黄曲霉毒素B1诱导S期阻滞L02细胞肝毒性新机制
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一起来看今天的单细胞测序文献：
标题：Single-cell sequencing reveals novel mechanisms of Aflatoxin B1-induced hepatotoxicity in S phase-arrested L02 cells
期刊：Cell Biology and Toxicology（“细胞生物学与毒理学”是一份国际性期刊，发表在细胞生物学、遗传学、分子和细胞毒理学领域的高科学水平的论文）
2021 IF: 6.691
发表时间：2020.7.1
关键词：单细胞测序、精准毒理学、黄曲霉毒素B1、DNA甲基化、细胞周期阻滞
技术方法：单细胞RNA-seq、单细胞RRBS-seq
1、研究背景：
黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1 ,AFB1）被国际癌症研究机构（IARC）归类为І类致癌物，广泛分布于自然界，对人类和动物健康构成严重威胁。大量研究证据表明AFB1诱导的毒性包括抑制细胞增殖、氧化应激、DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡，特别是针对肝脏细胞具有强烈的毒性。细胞周期是多细胞生物维持体内平衡的必要过程，S期是DNA复制的关键时期，而AFB1诱导细胞周期阻滞机制需要进一步研究。表观遗传修饰是AFB1诱导毒性的另一种调节机制，但AFB1毒性的表观遗传机制目前尚不清楚，需要进一步探讨。作为一种重要的表观遗传修饰，真核细胞中启动子的异常甲基化可能导致必需基因的沉默，影响其相关的转录通路，从而导致各种疾病和癌症的发生和发展。传统的DNA甲基化检测技术主要针对大量细胞或组织样品，难以避免细胞异质性和临界低丰度信号丢失的可能性。单细胞测序技术的出现和发展克服了上述限制，并提供新方法来准确揭示单细胞水平的表现和机制。
2、研究摘要
本研究通过单细胞RNA-seq和RRBS-seq测序方法研究了AFB1诱导S期阻滞L02细胞肝毒性的机制，AFB1可诱导细胞凋亡和细胞周期S期阻滞，降低线粒体膜电位(ΔΨm)，增加活性氧(ROS)生成。通过促性腺激素释放激素受体通路，Wnt信号传导通路，TGF-β信号通路等调节DNA甲基化水平。
3、项目设计：
（1）样本选取：
将永生化肝细胞系L02在补充有10％胎牛血清（FBS），100 U / mL青霉素，100 μg/ mL链霉素，250 ng /mL两性霉素B（Amphotericin B）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，2 mM L-谷氨酰胺和1％MEM非必需氨基酸，在37°C和5％CO2和95％饱和大气湿度的条件下。
（2）项目设计流程图：
4、研究结果：
（1） 经AFB1处理后，L02细胞的存活率显著降低，呈剂量依赖性（图1a）
将AFB1的20μg/mL和60μg/mL浓度作为实验的低剂量组和高剂量组，结果显示低剂量组和高剂量组的荧光强度明显高于对照组（control group，CK），表明AFB1增加L02细胞中ROS的生成（图1b）。用低剂量和高剂量浓度的AFB1处理L02细胞24h后，相对ROS-DHE荧光（图1d）超过CK组的1.71倍，而高剂量组则升至CK组的1.92倍；高剂量组中ΔΨm的荧光强度则显著低于CK组，相比降至约86%（图1c和e），而低剂量组则无明显差异。
图1
（2） 单细胞RNA-seq和单细胞RRBS-seq结合揭示AFB1诱导L02细胞肝毒性机制
在图2a中可以明显观察到AFB1诱导L02细胞凋亡，特别是在箭头所示区域。使用Image J进一步量化凋亡小体，验证了在AFB1处理组中凋亡小体的数量明显超过CK组。此外，如图2d所示AFB1处理组中5mC / (5mC+C)的占比高于CK组，但不显著，说明AFB1在一定程度上诱导了DNA甲基化水平的升高。
将细胞周期L02细胞分别用20μg/mL和60μg/mL浓度的 AFB1处理24 h后，通过流式细胞仪检测L02细胞周期分布，结果显示AFB1诱导L02细胞周期阻滞于S期（图2b、c），S期是DNA复制的特定时期，由于DNA暴露并积极复制，AFB1的毒性风险更大。
通过细胞分选，每组采集50个S期细胞进行单细胞RNA-seq和单细胞RRBS-seq测序分析，单细胞RNA-seq发现低剂量组与CK组共882个差异表达基因（DEGs，,log 2 | fold change | >1 and p<0.05），其中423个表达上调，459个表达下调。与CK组相比，高剂量组有更多的DEGs(1011个)，其中596个表达上调，415个表达下调。
利用PANTHER数据库对涉及以上DEGs的信号通路进行分析，分析结果显示20 μg/mL 浓度的低剂量AFB1主要影响促性腺激素释放激素受体通路、CCKR信号通路和Wnt信号通路，而60 μg/mL浓度的高剂量 AFB1主要影响整合素信号通路、趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症反应及凋亡信号通路。根据上述结果，对趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症反应中的三个必需基因（CXCL8，PTGS2，IL1B），细胞周期通路中的两个重要基因（P21，GADD45A）和两个明显的差异表达基因（ATF3，选择凋亡信号通路中的BIRC3）进行qPCR分析，qPCR分析结果与单细胞RNA-seq结果一致（图2e）。
将单细胞RRBS测序中获得的DNA甲基化数据，通过CGmap Tools进行差异甲基化区域（DMR）分析获得差异甲基化基因（DMGs），比较低剂量组和CK组时获得163个DMGs，其中76个高甲基化，87个低甲基化。与CK组相比，高剂量组有191个DMGs，其中81个高甲基化，110个低甲基化。结果发现单细胞RRBS-seq和单细胞RNA-seq中DMG富集的信号传导通路相似，包括促性腺激素释放激素受体通路、整合素信号通路和Wnt信号通路。此外，高剂量AFB1诱导的DMGs也和其他重要通路如TGF-β信号通路和血管生成有关。
基于单细胞RRBS和单细胞RNA-seq结果的结合，发现AFB1诱导的信号传导通路如Wnt信号通路中几个关键基因表达的改变可归因于它们DNA甲基化状态的改变。因此，研究人员提出了AFB1诱导的S期阻滞L02细胞肝毒性调节机制的假设（图2f）。
图2
5、易基因小结：
在这项研究中，作者将单细胞RNA-seq分析与单细胞RRBS-seq分析相结合，揭示了AFB1对S期阻滞L02细胞诱导的肝毒性机制，其中DNA甲基化通过调控促性腺激素释放激素受体通路、Wnt信号传导通路和TGF-β信号通路发挥作用，为进一步研究精确毒理学提供了新的探索策略，包括靶细胞选择、多组非定向测序和通路分析。
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文献来源：doi.org/10.1007/s10565-020-09547-z
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原文解读