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大家好！今天跟大家分享的是2020年5月发表在Cancer Cell International（IF = 4.175）上的文章。文章利用从TCGA数据库中搜集的子宫内膜癌（EC）数据，分析了其中差异表达的lncRNA及其预后价值。并且使用多种生物信息学在线工具和数据库进一步探讨了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的转录因子（TFs），竞争性内源RNA（ceRNA）机制，功能调节网络和免疫浸润，说明了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17在EC的发生发展中可能起关键作用，并且可以作为EC的潜在预后生物标志物。

题目：Identification of long noncoding RNA RP11-89K21.1 and RP11-357H14.17 as prognostic signature of endometrial carcinoma via integrated bioinformatics analysis

通过整合生物信息学分析鉴定长非编码RNA RP11-89K21.1和RP11-357H14.17作为子宫内膜癌的预后标志

摘要

子宫内膜癌（EC）是妇科中最常见的恶性肿瘤之一。长链非编码RNA（lncRNAs）在EC发生和发展中的潜在功能和机制仍不清楚。因此探索lncRNA的签名对于提供EC的预后价值具有重要意义。本文首先确定RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的高表达与EC患者的总体生存期缩短（OS）和预后不良密切相关。还阐明了与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17相关的转录因子和共表达基因的网络。此外，通过2个lncRNA（RP11-89K21.1和RP11-357H14.17），11个miRNA和183个mRNA构建了ceRNA调控网络。功能富集分析表明，RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的靶标基因与癌症中的miRNA、血管发育、生长调节、生长因子和细胞分化等功能密切相关，并在包括癌症生物学通路、癌症中的miRNA和凋亡信号通路在内的生物学通路中富集。本文首次证明RP11-89K21.1和RP11-357H14.17在EC的发生发展中可能起关键作用，并且可以被视为EC的潜在预后生物标志物。

流程图

1. 数据的获取和整理

本文利用cirlncRNAnet间接获取了TCGA数据库中EC的lncRNA表达数据，并使用GEPIA中的数据进行了进一步分析。

2.用circlncRNAnet和GEPIA鉴定子宫内膜癌（UCEC）样本中差异表达的lncRNAs

为了研究lncRNA在UCEC的发生发展中的作用，本文首先在cirlncRNAnet的LncRNA-TCGA模块中鉴定了差异表达的lncRNA。在UCEC中总共检测到10978个lncRNA，其中121个lncRNA失调（77个上调和44个下调）。本文使用GEPIA进一步验证了121种差异表达的lncRNA在UCEC中的表达，发现在UCEC中只有RP11-89K21.1和RP11-357H14.17显著差异表达（图1a，b），与cirlncRNAnet的结果一致。UCEC中CTD-2314B22 0.1，CTD-2377D24.6，RP11-657O9.1和LINC00668的表达高于正常组织，但差异无统计学意义（图1c-f）。与正常组织相比，UCEC中AP000892.6，ACTA2-AS1和RP11-867G23.10的表达明显降低（图1h-i）。

图1

3. 用GEPIA分析UCEC中差异表达RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的预后价值

本文进一步使用GEPIA探索了UCEC中121个差异表达的lncRNA的预后价值。结果表明，UCEC中RP11-89K21.1、RP11-357H14.17、CTD-2314B22.1，CTD-2377D24.6、RP11-657O9.1和LINC00668的高表达与总生存期（OS）缩短显著相关（图2a-f）。此外，UCEC中AP000892.6、ACTA2-AS1和RP11-867G23.10的表达降低，而AP000892.6，ACTA2-AS1和RP11-867G23.10的高表达与不良预后显著相关（图2g–i）。生存曲线显示RP11-89K21.1、LINC00668和ACTA2-AS1的高表达也与OS相关，RP11-357H14.17、CTD-2377D24.6和AP000892.6则与OS无相关性。综上所述，RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的高表达可能在UCEC的发生，发展和预后中起重要作用。

图2

4. RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的细胞定位和共表达基因

lncRNA的细胞定位在其功能和分子机制中起着至关重要的作用，本文使用lncLocator探索了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的亚细胞定位。结果表明，RP11-89K21.17主要位于胞质和胞质中，RP11-357H14.17主要位于胞质和核糖体中（图3a）。说明RP11-89K21.1和RP11-357H14.17更有可能通过ceRNA网络发挥其生物学功能和潜在机制。本文进一步探索了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的共表达基因，并通过Circos图和circlncRNAnet的热图可视化。图谱显示与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17相关的前50个共表达基因的染色体分布，它们主要位于常染色体中。2号染色体（RP11-89K21.1所在的位置）和7号染色体（RP11-357H14.17所在的位置）没有显著富集。热图表明AC012354.6、SIX3、SIX3-AS1和Six3os1_1 / 2/4/5是RP11-89K21.1共表达基因，CTD-2377D24.6、HOXB- AS4、HOXB9和MIR196A1是RP11-357H14.17的共表达基因（图3b，c）。

图3

5. RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的转录调控和蛋白质相互作用

本文通过AnnoLnc研究了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的转录因子（TFs）和结合蛋白。发现31个TF与RP11-89K21.1相关，42个TF和RP11-357H14.17相关，有21个TF与两个lncRNA共同相关（图4a）。本文发现UCEC中EZH2的表达显著升高，而UCEC中TCF7L2的表达显著降低。UCEC中其他TF的表达水平无显著差异（图4b）。本文进一步使用starBase研究了EZH2表达与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17正相关（图4c）。基于相关系数太小，本文利用GEPIA进一步探讨了EZH2与RP11-89K21.1，RP11-357H14.17之间的相关性，结果表明EZH2的表达与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17均呈正相关（图4d）。此外，RP11-89K21.1的结合蛋白包括CBWD7、GUSB、ABRA、MTUS2、VAMP4（图4e），RP11-357H14.17的结合蛋白包括CLIC1、CNN2、TCTN1、TMEM240和ZNF836（图4f）。转录因子（图4e）和结合蛋白（图4f）的网络通过GeneMANIA可视化。

图4

6. lncRNA–miRNA–mRNA调控网络的构建

lncRNA的亚细胞位置与其在肿瘤中的潜在功能和机制密切相关。本文发现RP11-89K21.1和RP11-357H14.17都主要位于细胞质中，并且RP11-89K21.1和RP11-357H14.17可能通过ceRNA机制实现了生物学功能。因此，利用AnnoLnc预测了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的结合miRNA。starBase进一步验证了潜在miRNA的表达。结果显示22个miRNA家族和10个miRNA家族分别与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17相关。有5个miRNA家族与两个lncRNA都相关（图5a），其中miR-27b，miR-4770，miR-143，miR-204在UCEC中的表达为显著下降（图5b-h）。UCEC中miR-125a-5p，miR-125b-5p，miR-139-5p，miR-670-3p，miR-24-1-5p，miR-503的表达也显著降低。将miR-27b、miR-4770、miR-143、miR-204、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-139-5p和miR-670-3p视为RP11-89K21.1的候选靶标miRNA。将miR-27b、miR-4770、miR-143、miR-204、miR-24-1-5p和miR-503视为RP11-357H14.17候选靶标miRNA。、miRTarBase进一步预测了候选miRNA的靶向mRNA。Cytoscape构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，网络中包含2个lncRNA（RP11-89K21.1和RP11-357H14.17）、11个miRNA和183个靶基因（图6）。

图5

图6

7. lncRNA靶基因的功能富集分析

为了探索RP11-89K21.1和RP11-357H14.17在UCEC的发展中的潜在功能和机制，通过Metascape分析了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17靶向基因的GO和KEGG富集分析。GO显示，RP11-89K21.1靶向基因主要富集与参与转录因子复合物和细胞质的核周区域，还调节近端启动子序列特异性DNA结合、磷酸转移酶活性、酶和生长因子结合（图7a–d）。RP11-89K21.1靶向基因的生物学过程主要涉及血管发育、细胞死亡和分化调节、组织形态发生以及对生长因子的反应（图7e-f）。RP11-357H14.17靶向基因主要位于细胞质的核周区域，参与了细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体，黏附连接和转录因子复合体，还调节了蛋白激酶活性、转录因子和激酶结合等功能（图8a-d）

RP11-89K21.1靶向的基因主要参与生物学过程有血管发育、转移酶活性调节、凋亡信号通路、细胞死亡和细胞分化调节以及对氧水平的响应（图8e-f）。

KEGG富集分析表明，RP11-89K21.1靶向基因在癌症的途径，内分泌抗性和癌症的miRNA，调节apelin信号传导途径，Th17细胞分化和hippo信号传导途径中显著富集（图7g，h）。RP11-357H14.17靶向基因显著富集于癌症途径，癌症中的miRNA，PI3K-AKT信号传导途径，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号传导途径，细胞周期和细胞因子介导的信号传导途径（图8g，h）。这些信号通路对于包括子宫内膜癌在内的多种肿瘤的发生和发展中起着关键作用。此外，为了更好地理解RP11-89K21.1，RP11-357H14.17和UCEC之间的关系，本文使用Metascape进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）富集分析（图7i，8i）。

图7

图8

8. RP11-89K21.1，RP11-357H14.17的表达与ImmucLnc免疫浸润的相关性

为了研究RP11-89K21.1，RP11-357H14.17与免疫浸润之间的关系，使用ImmucLnc数据库检测RP11-89K21.1（CD8_T细胞，巨噬细胞，树突状细胞），RP11-357H14.17（BMSCs和CD4_T细胞以及中性粒细胞）相关的免疫细胞类型。本文发现RP11-89K21.1的表达与CD8_T细胞和巨噬细胞呈负相关，与CD4_T细胞和中性粒细胞正相关（表1）。RP11-357H14.17的表达与CD8_T细胞呈负相关，与CD4_T细胞呈正相关（表2）。

表1

表2

结语

本文通过一系列综合数据库首次证明了RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的高表达与EC患者的不良预后密切相关。进一步鉴定了转录调节因子，共表达的基因，RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的相互作用蛋白。生物学功能的调控网络，信号传导途径可能有助于阐明EC中RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的潜在功能和机制。本文推测与RP11-89K21.1和RP11-357H14.17相关的ceRNA网络为EC引发和发展的分子机制。

文章的亮点在于使用了多种生物信息学工具和数据库，使文章内容非常饱满，不足之处是分析内容较多，主线不清晰，结果讨论需要加强。RP11-89K21.1和RP11-357H14.17的功能实验也需要进一步补充。

附本文用到的生物信息学工具和数据库：

CirclncRNAnet (http://120.126.1.61/circlnc/index.php) ：用于探索TCGA数据库中lncRNA和circRNA测序表达数据的分析工具；

GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) ：癌症测序表达数据及分析工具；

The Kaplan–Meier (KM) Plotter (http://kmplot.com)：生存曲线分析工具；

UCSC (https://genome-asia.ucsc.eduk/index.html)：基因注释信息；

LNCipedia (https://lncipedia.org) ：是人lncRNA转录序列和结构的注释数据库；

LncLocator (https://LncLocatorwww.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/) ：预测lncRNA的亚细胞定位；

AnnoLnc (http://annolnc.cbi.pku.edu.cn) ：lncRNA注释数据库；

StarBase (http://starbase.sysu.edu.cn/) ：非编码RNA相互作用关系分析数据库；

GeneMANIA (http://www.genemania.org) ：可视化功能及调节网络；

miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php) ：miRNA靶标基因数据库；

Metascape (http://metascape.org)：GO及KEGG富集分析及可视化；

ImmLnc (http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/ImmLnc)：研究lncRNA免疫相关功能工具。