成功修复隐性遗传疾病！刘如谦团队用CRISPR恢复了耳聋小鼠听力
叶韦熙（Wei Hsi Yeh）在读本科期间，她的一位密友突然毫无征兆地双耳失聪，医生无法诊断出病因。直到数年后，她作为第一作者，与 Broad 研究所 CRISPR 大牛刘如谦（David Liu）博士一起，于近日发表了一篇单碱基编辑治疗耳聋小鼠的论文，并登上 Science Translational Medicine 的封面。
（来源：Science Translational Medicine）
在美国，12 岁以上的人中有八分之一都患有听力障碍，尽管通过助听器或人工耳蜗可以部分缓解听力损失，但是有一半多的人都是遗传性疾病，目前或许只有基因编辑可以从生物学角度真正解决这个问题。两年前，叶韦熙和刘如谦联合其他研究人员首次修复了显性突变并阻止听力下降。但是刘如谦认为，包括遗传性听力损失在内的大多数遗传疾病不是由显性突变引起的，而是由隐性遗传引起的。
而这篇论文主要是通过双 AAV 载体递送单碱基编辑器，从而恢复 Tmc1 基因隐性突变导致的完全耳聋小鼠的听力。
这是世界首个成功利用基因编辑技术修复隐性致病突变的实验。在经过完善之后，或许亦可以用来改善 Tmc1 突变患者的听力。
图 | 刘如谦（来源：Stat）
几乎没有可检测到的脱靶
人类或动物的听力主要依赖于内耳的毛细胞，买细胞在声波压力下弯曲并向大脑发送电脉冲，Tmc1 基因的隐性突变导致这些毛细胞迅速退化，孩子在四周大的时候就会彻底丧失听力。
由显性突变引起的遗传疾病，其基因的两个拷贝中只有一个出错，因此破坏或者沉默有问题的显性基因可能是有效的。但是因为大多数遗传性听力丧失都是隐性突变导致的，这就意味着有两个错误的拷贝，因此必须要修复或者替换该基因，而不是整体切除。
此前，哈佛医学院耳鼻喉科和神经病学教授、该文作者之一 Jeffrey Holt 曾试图使用腺相关病毒载体（AAV）把功能性拷贝的 Tmc1 基因递送到不健康的细胞中，结果发现可以恢复聋小鼠的听力。但是这种方法持续时间有限，并且研究人员担心递送外源基因可能会因基因的过度表达而引起并发症。
而基因编辑技术可以直接修复突变基因，并且可能会终生有效。
图 | 小鼠耳蜗的共聚焦显微镜图像，绿色的毛细胞。未经处理的具有 TMC1 突变的小鼠耳蜗，显示出毛细胞丢失（左）。来自同一只小鼠的经处理的耳蜗，具有毛细胞保存功能（右）（来源：Science）
因此，在这项研究中，他们选择使用 CRISPR 技术，但是因为 CRISPR 的传统编辑方法是对 DNA 片段整体进行剪辑或切除，所以他们使用了改造后的 CRISPR 技术——碱基编辑，这样可以找到并重写基因编辑中的错误，而不是整体切除 DNA 片段。
尽管碱基编辑器（Base Editor）在细胞实验中效果显著，但是在动物试验中，因为碱基编辑器太大，无法被 AAV 容纳和递送。所以研究人员选择把编辑器分为两半，并用两个 AAV 共同递送，到内部之后，两个 AAV 共同感染同一细胞，被分开的编辑器重新结合并寻找靶点。
研究人员给出生一天的有 Tmc1 突变的小鼠注射了药物，他们发现这种疗法成功地编辑了错误的 Tmc1 基因，小鼠耳朵里出现功能正常的毛细胞，能够传递声音信号。
叶韦熙也进行了非正式测试，她拍了拍手，以前丧失听力的老鼠跳了起来并且回头去看。正式测试显示，基础编辑器至少可以部分起作用：经过处理的小鼠的听力已部分恢复，可以对响亮的声音甚至某些中等的声音做出反应。
“我们几乎没有看到可检测到的脱靶”，刘如谦说，“而且我们注意到，经过编辑的动物具有保存完好的毛细胞形态和信号转导，这意味着将声波转换为神经元信号的关键细胞毛细胞重回正常，行为也更正常。”
这项关于听力治疗的研究还在进行中，小鼠虽然能听到 60 分贝左右的声音，但是正常听觉动物可以听到 30 分贝柔和的声音，这是研究人员的下一个目标。另外，经过治疗的小鼠在六周后仍会出现听力下降现象，这也有待进一步研究。
精准、灵活的碱基编辑器
CRISPR 基因编辑工具不仅为未来基因工程和治疗提供了全新的方案，也为基因的全面研究及其在生命中的重要性探索提供了强大的工具。但是因为使用该工具需要进行大量的碱基修改，容易出现脱靶效应。
而基于 CRISPR 改良后的碱基编辑技术可以实现单个或者两个碱基的替换或增删，不会造成 DNA 链断裂。
2016 年，刘如谦团队研发出首个可编辑 DNA 单碱基编辑器 CBE（Cytosine Base Editor），可以将 C-G 碱基对转变成 T-A 碱基对；不久，该团队又获得可将 A-T 碱基对转变成 G-C 碱基对的碱基编辑器 ABE（Adenine Base Editor）。以 CBE 为例，可以重构单碱基 C 的分子结构，使其重组为 T，从而触发细胞对其他 DNA 链进行修复以完成整个转换过程。而最终的结果就是 C-G 碱基对被成功转换为 T-A 碱基对。
2017 年，刘如谦凭借 “碱基编辑器” 当选《自然》年度 10 大人物。
（来源：MIT TR China）
去年，刘如谦团队进一步开发出超精确的新型基因编辑工具 PE（Prime Editors），可实现 ATCG 四种碱基间所有 12 种单碱基的自由“改变”，并且能有效实现多碱基的精准增删，CRISPR 先驱、哈佛大学化学家 George Church 评价称：“这是朝着正确方向迈出的一大步。”
参考：
https://stm.sciencemag.org/content/12/546/eaay9101
https://chemistry.harvard.edu/news/promise-restore-hearing
https://www.fiercebiotech.com/research/david-liu-s-new-gene-editing-technique-restores-hearing-mice
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