promega质粒提取试剂盒操作说明（中文）

注意:所有纯化和洗脱步骤均在室温下进行。

1. 将转化大肠杆菌细胞在最佳培养条件下培养50-250ml过夜(16 - 21h)。

注意:本方案优化为过量培养50-250ml，OD600 = 2-4。

2. 将细菌收集起来，5000 g离心10分钟，弃上清。用纸巾除去多余的介质。

表1  解液所需的溶液体积。

3. 在细胞重悬液中重悬细菌。

4. 加入细胞裂解液和轻轻混合翻转管3-5次或混合裂解液轻轻滚动。 室温下孵育3分钟。

注:如果细胞裂解液过冷，可能会发生SDS沉淀，导致细胞裂解不良。 如果有沉淀形成，将细胞裂解液加热到37°C，并轻轻摇晃。

5. 在溶解细胞中加入中和液，盖住并轻轻翻转5-10次。

6. 15000g室温离心15分钟。 这种离心法将使颗粒化大量的细菌碎片。 使用PureYield™清除柱清除剩余碎片。 要区分PureYield™Clearing和PureYield™Binding列，请注意过滤管是蓝色的，而结合柱是白色的。

7. 通过在PureYield™顶部嵌套一个PureYield™(蓝色)组装。 如图1所示，将组装好的柱堆放在真空泵上。

图1所示。 蓝色清除列插入白色绑定列。

8. 将澄清的裂解液倒入PureYield™澄清柱中。不要让颗粒状的碎片落入管内。

9. 启动真空泵。 裂解液将通过PureYield™澄清柱中的澄清膜，并且 DNA将在PureYield™结合柱中结合到结合膜上。 继续抽吸所有的液体都通过了两个柱。

注意:所有纯化和洗脱步骤均在室温下进行。

10. 在进行前，从过滤装置中缓慢释放真空。 移除PureYield™清除柱，将PureYield™结合色谱柱留在泵上。

注意:如果真空释放得太快，膜可能会从柱上分离。 如结合膜脱落，用带手套的手指或1.0ml无菌溶液的大端轻轻轻拍 移液器尖端，或打开真空，让压力重新安置膜。

11. 向柱中加入5.0ml的内毒素清除液，让真空泵将溶液穿过 。 为了便于使用，PureYield™中底prep柱标记有5、10和20ml填充刻线。

(图2).缓冲器可以移液或小心地倒到适当的体积。

图2  PureYield™midprep结合柱标记有5,10和20ml填充刻线。

12. 在柱上加入20ml柱洗液，让负压将溶液吸出。

13. 在真空泵中干燥膜30秒至1分钟。 干燥后，DNA的顶部结合膜应该是干燥的，没有可检测到的乙醇气味。 如果DNA结合膜顶部显得潮湿或有可检测到的乙醇气味，重复真空干燥30秒。

14. 从真空泵上移除PureYield™结合柱。 在纸上轻敲柱子的顶端用无尘纸擦去多余的乙醇。 将柱放入一个新的50ml一次性离心管管(如康宁或 猎鹰™)。

15. 将1.5ml微型离心管放置在Eluator™真空洗脱装置的底座上，固定管阀盖处于开启位置，如图3所示(图A) 。

16. 组装洗脱器™设备，并将DNA结合柱插入其中，确保柱是充分的组装在上面。

17. 将Eluator™设备组件放置在真空歧管上(图3，图B) 。

18. 在DNA结合柱中加入400-600μl 无核酸酶水。 使用最大真空度抽1分钟 或者直到所有的液体都通过柱子。

注:洗脱量会影响浓度和得率。 当使用Eluator™真空洗脱时400μl的洗脱量比600μl的洗脱量高，但产率低。 如果收益率 比浓度更重要的是，将洗脱体积增加到600μl。 DNA得率会很差如果洗脱体积小于400μl。

19. 取下试管，进行DNA定量和凝胶电泳分析。

图3。 通过真空泵洗脱

A.将1.5ml微型离心管放置在Eluator™底座上真空洗脱装置和微型离心管盖如图所示锁定。

B.最终洗脱器™ 真空洗脱装置组件，包括绑定柱，准备用于真空泵上。  × g转速洗脱5分钟后，洗脱体积、DNA浓度及产率 。

注:洗脱量会影响浓度和得率。 使用600-800μl的洗脱体积。 使用一个 与800μl的洗脱体积相比，600μl的洗脱体积的浓度更高，但产率更低。 如果产率比浓度更重要，则将洗脱体积增加到800μl。 DNA恢复将是 如果洗脱量小于400μl，则质量较差。 不过，可以通过第二次洗脱获得额外的DNA 纯度可能会受到影响。 两种洗脱的总回收率不应超过1.0ml。

注意:如果后续应用需要更高的浓度，请执行乙醇沉淀