【规范与指南】血液样本微生物游离DNA的NGS检测原理与应用
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已知可引起人类疾病的微生物多于1000种，病原学的探寻始终是感染性疾病诊治的重要环节，对于一些类型的感染性疾病，病因的探求仍然存在很大的困难，尤其对于血流感染，超过50%尚不能明确病因。随着病原NGS的广泛应用和不断成熟，已成为感染检测的重要手段。本文将以血液样本的病原微生物NGS检测为主要内容，对其检测流程、特征、临床应用、阈值、性能验证与质控进行介绍与分享。
病原mNGS检测的原理如左图所示，相对于非感染人群，患者的临床标本中如果某种微生物核酸大量检出，而非感染人群中该微生物核酸量未检出或明显低于感染患者，则意味着该微生物是感染病原体的可能性较高。
病原mNGS检测流程包括标本采集、运输、核酸提取和富集、建库测序、生信分析以及可疑病原菌报告。检测流程受到众多的因素影响。标本的优化选择、快速的转运、恰当的保存、人源背景的处理、合理提取及建库试剂盒的选择、测序的平台、深度、测序序列长度、数据库分析、合理化报告都会直接影响到报告的质量。
整个mNGS检测的过程，就好比这样的一个过程：样本就像一个上了锁的书箱，箱子里的书本就是人与微生物的基因组。由于受限于目前的技术，无法轻松的打开箱子获取其中的完整信息，因此我们采用一系列湿实验的方法，把这个箱子摧毁，这时书本已经被损坏，变成了一张张碎纸条，这些碎纸条就是所谓的DNA片段，经测序后变成了我们说的reads。
碎纸条上由四种字符组成-“ATCG”，基于这些碎掉的片段，我们去图书馆查找出处，这里的图书馆就是大家常说的“基因组数据库”。例如“假作真时真亦假，无为有处有还无。”我们可以还原到《红楼梦》。在报告中的读长数（reads）即是我们拿到纸条的数目，如果我们看到很多的纸条都来自同一本书（比对到同一微生物的序列数较高），覆盖的书本章节越多（基因组的覆盖度越高），则代表其更加可靠。
血液样本的病原NGS检测与组织、肺泡灌洗液等这些标本不同，其检测的主要是血浆中的游离核酸-cfDNA。而组织、BALF、痰液等标本中，其病原主要以菌体形式存在，核酸是存在于病原细胞中的，所以对于这类标本会存在“破壁”的过程，让核酸释放出来再进行检测，这个过程与病原的破壁难易程度直接相关，例如隐球菌、结核菌的破壁是较为困难的，而血浆cfDNA受到这些因素的影响较小。
微生物游离DNA(mcfDNA)的两个来源，1).微生物（细菌，病毒或噬菌体）易位。例如，在胃肠道中，肠道微生物过度生长，当肠粘膜屏障通透性增加或宿主免疫防御功能受损时，微生物可进入血液循环。2).当组织粘膜发生局部感染或物理损伤时，这些入侵的微生物可以被抗菌药物及免疫反应杀死并分解，则病原体可释放入血和/或核酸片段入血。
血浆中的cfDNA浓度差别很大，有研究显示，健康人血浆cfDNA浓度波动范围在0.1ng/μl-1.5ng/μl之间，人类DNA占绝大多数(>90%或甚至>99%)，而微生物DNA只占很少的比例。血浆中cfDNA浓度升高可见于多种病理情况下，如感染、脓毒症、创伤和自身免疫性疾病等。该图为急诊疑似脓毒症的350例患者的血浆cfDNA浓度分布。
血液cfDNA浓度可直接影响病原NGS检测的灵敏度，过高的人源背景会导致病原检测限上升。灵敏度在固定的人源背景（核酸浓度）下，可通过提高测序深度加以改善。图表左侧的测序深度高于右侧，则检测限低于右侧。
与血培养不同的是，血液mcfDNA检测容易受到溶血、乳糜血的影响，与高人源背景的影响相似，当标本出现严重的溶血、乳糜血时，微生物检出不足，容易造成假阴性。
血浆mcfDNA检测已在临床感染的诊治中发挥了重要的作用，如脓毒症、社区获得性肺炎、结核病、侵袭性真菌病、尿路感染、器官移植后感染及不明原因发热等。与传统微生物检测相比，mcfDNA阳性率更高。
在2019年的Nature Microbiology上发表的血浆mcfDNA高通量测序研究中，临床纳入了348例疑似脓毒症患者，与首次阳性的血培养相比，其阳性符合率（positive agreement）为93.7%，在首次血培养阴性的患者中，有60%的患者通过NGS检测获得了阳性的结果。
在该项脓毒症研究中对于判断其是否为病原的评估标准是非常值得学习的。其充分纳入了血培养与其他传统微生物检测技术的全面考量，微生物检测方法包括血培养、抗原抗体血清学检测、核酸检测。在对临床评估方面，也充分考虑到检出微生物在其他研究是否可引起类似的症状以及宿主的特殊性等。
2020年，CharlesLan gelier的一项研究表明，对于危重患者，血浆标本mNGS可以检测到病原体的cfDNA，在血培养阴性的肺炎患者中，病原体DNA释放到血液中可能比我们认识中的更常见，虽然血浆标本的mNGS没有呼吸道标本的mNGS的信息丰富，但在没有呼吸道标本的情况下，仍具有检测肺炎病原体的价值。
尽管血浆mcfDNA检测对于感染病因诊断起到了重要的作用，但从检测灵敏度的角度看，血液其并非是最优的标本。感染灶部位的无菌标本内其病原核酸载量是高于血浆mcfDNA的。并且，不同微生物其核酸载量也是不同的，其中，金黄色葡萄球菌甚至可以造成原发灶无菌体液的NGS漏检，其可能原因是，金黄色葡萄球菌的感染往往伴随白细胞大量富集，人源背景核酸载量过高，导致病原的检测限上调，灵敏度下降。
在mcfDNANGS检测的高灵敏度同时，我们也需要看到，NGS检出往往的微生物较多，为临床解读也带来了困扰。在无症状人群进行血浆的NGS检测结果中，有22.8%的样本可以检出可报告病原，其中大部分为单种微生物，常见的微生物为幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌，后两者为人体常见共生菌。
目前对于mcfDNA的检测结果的报告逻辑更多的是客观呈现样本中是否存在相关病原的核酸片段，因此目前的报告阈值更多的是考虑其存在是否真实，对于是否为真实的感染病原需要充分结合临床情况和其他检查结果进行解读。
对于血液cfDNA检测，mNGS目前尚无公认的阈值，各类文章报道的划分阈值的方法与标准也大不相同，对于特殊的病原体（如结核），由于其检测难度以及病原的重要性也会有更加宽泛的阈值。
ROC曲线法是设定阈值cutoff值的最佳方法，其原理是基于特定方法（如血培养、PCR等）确定阴阳性结果的数据集，对特定指标进行分析筛选出最佳性能对应的阈值。如我们想基于reads数来确定最佳阈值，以1条为cutoff我们可以计算得到对应的灵敏度和特异性，以2条为阈值计算，以3条为阈值计算，依此类推，从中筛选出灵敏度和特异性最佳的cutoff即为阈值。
以ROC曲线划分阈值的范例：2020年，CharlesChiu课题组通过检测多种不同的体液样本比较二代测序与纳米孔测序的结果，其中基于ROC的方法开发了2种阈值划分体系，基于种水平特异性reads数以及基于矫正后的reads数。
对于血液样本基于cfDNA的阈值的确定并非一个简单的事情，影响因素包括：
1.判断真阳性的“金标准”不足。如果我们以血培养作为金标准去界定真阳性，因可培养微生物的局限性会导致真阳性判断不足，而血液标本直接进行细菌、真菌分子学试验也存在一定的局限性。
2. NGS的检测能力受到血浆cfDNA浓度影响，其阈值的界定应考虑人源比例。
3. 从生信层面，一个微生物的检出是否可靠，除了需要考虑基本的reads数，还需考虑基因组的覆盖情况，同源物种干扰等。
在2019年的nature microbiology的文章中，对感染性血液cfDNA检测的性能验证及质控有了详尽的描述，本文以这篇文献为例作为分享。该试验流程纳入多环节的全自动化方式，极大程度的减小了外源核酸的引入，其性能验证完备、质控体现严谨，定量检测结果稳定，是今后血液cfDNA检测的优秀范例与发展方向。
在检测的流程上，Karius检测的特点：1.采用自动处理平台进行cfDNA提取和建库。2.在数据库方面，使用的为临床级别的数据库。3.报告病原cfDNA分子浓度（定量检测）。
在性能验证方面，Karius检测选择了可充分代表其临床可报告物种（CRR）特征的标准品，并对标准品进行片段化处理并加入到健康人的血浆中，对检测限、定量限、精密度、特异度进行了测试。
在该文章中，对质控体系也进行了细致的描述，在临床样本检测过程中，通过添加批次内质控（阴控+阳控）和样本内质控（ID Spike 和 WINK分子）进行质量把控。ID Spike用于监控标本间的交叉污染。WINK分子用以监测数据产出，通过计算WINC分子数来确定报告微生物的定量分子浓度。批次内质控包含环境对照（阴控）监测环境背景，分析对照（阳控）分别添加固定分子浓度的表葡、大肠、铜绿和烟曲霉，当四种微生物检出浓度在范围内认为检测有效。
小结，血液中cfDNA浓度分布广泛，其中仅1~5%为微生物的核酸片段。微生物核酸片段的来源主要为微生物菌体入血和核酸片段入血。通过血液mcfDNA检测可对多种临床感染起到诊断的辅佐作用。建立mNGS血液检测阈值的影响因素较多，目前尚无成熟的阈值。性能验证、质控体系是检测质量的重要环节，把控质量、优化性能是提升检测水平的重要手段。在这项技术应用越来越广泛的今天，只有对这项技术不断的学习，全流程掌握，以临床应用作为优化的出发点，加强合作才能使用好病原mNGS检测的这把“利剑”。
参考文献（上下滑动）
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徐春晖
中国医学科学院血液病医院 协和博精实验室 病原微生物主管技师；中国中西医结合学会检验医学专业委员会感染疾病实验诊断专家委员会委员；参译《临床微生物学手册》第12版；以第一作者发表SCI及中文核心文章多篇。主要研究方向：血液病患者真菌感染；耐药菌的定植与感染；感染的mNGS检测。
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作者｜徐春晖、李立锋
单位｜中国医学科学院血液病医院、金匙医学
审校｜鲁炳怀、宁永忠