血脑屏障及中枢神经药物研发现状 | 高特佳Insights
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作者：高特佳博士后创新基地
今年8月20日是诺贝尔医学和生理学奖获奖者德国科学家保罗·埃尔里希（Paul Ehrlich）博士逝世106周年。埃尔里希博士除了最为人所知的在免疫学理论和血清疗法方面的研究工作外，还是“血脑屏障”现象首位发现者。1895年他发现外周注射染料后，脑部并不能被染色，虽然当时并未对该现象给出准确的解释，但他的这一发现直接开启了后续对血脑屏障（Brain-blood barrier，简称“BBB”）的深入研究。时至今日，深入研究血脑屏障上物质转运体，发掘其潜在的利用价值，对寻找治疗中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病的新药物作用靶点，更有效地治疗CNS疾病具有重要的意义，因此对于其的研究包括其结构、功能以及如何克服脑血屏障等方面在学术界与制药界（尤其是CNS药物公司）都有着广泛而深入的研究。
中枢神经系统疾病/药物简介
中枢神经系统疾病是指影响大脑或脊髓结构、功能的神经障碍，主要包括神经退行性疾病、功能性紊乱、结构性障碍、中枢神经系统感染等。最为人所知的中枢类疾病包括老年痴呆症（又叫阿尔茨海默症Alzheimer's disease，AD）、帕金森症（Parkinson's disease，PD）、抑郁（Depression）、精神分裂症（Schizophrenia）、癫痫 （Epilepsy）、中风（又叫脑卒中，Stroke），还有在肿瘤领域经常能听到的原发性脑瘤和脑转移（Brain metastasis）等。从更精确的分类上来说，约翰霍普金斯研究所将中枢神经系统的受损划分为以下几种情况：
感染：如脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎和硬膜外脓肿；
血管疾病：如中风、短暂性脑缺血发作(TIA)、蛛网膜下腔出血、硬膜下出血和血肿、以及硬膜外出血；
结构性疾病：如脑或脊髓损伤、贝尔麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、周围神经病和格林-巴利综合征；
功能障碍：如头痛、癫痫、失眠、神经痛、焦虑、抑郁症；
退化症：如帕金森病、多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease，HD）、阿尔茨海默病；
肿瘤：如脑部肿瘤、脑癌等。
中枢神经系统药物（CNS drugs）通常指的是治疗功能障碍或神经退化症的药品。这些损伤涉及到神经系统病源性破坏，往往难以治愈，患者必须长期服药。但随着基因以及细胞疗法的兴起，对于诸如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症以及亨廷顿舞蹈病等疾病能实现单次或者长时间间隔给药从而达到临床治愈的可能，在近年实现了突破性的进展。
CNS药物研发现状
据联合国卫生组织估算，目前全球约有1/6的人口受到神经疾病的困扰。中国CNS药物的销售收已由2015年的1440亿元增至2019年的2043亿元，年复合增长率为9.1%，预计2020年至2024年将以4.6%的年复合增长将进一步增长，并以高于的增长速度在2024年达到2509亿元。
虽然近年来随着CNS药物市场规模不断扩大，但相比于其他治疗领域，CNS表现出高风险、高收益的特征。高风险主要是因为CNS药物的研发非常困难，从临床一期到上市的成功率仅为8.4%。因此鉴于CNS药物的开发的高损耗率，许多制药公司已决定减少 CNS研究，有的甚至直接关闭了其CNS药物研发中心，例如GSK于2017年已关闭了中国的神经系统药物全球研发中心。具体来说，CNS药物研发的难点主要在于：
很多神经疾病的准确病因至今没有定论，药物只针对“症状”，难以治疗“根源”。这一点在AD领域表现得尤为明显，例如大家都熟知的β-淀粉样蛋白假说在经过了多次失败后才终于有好消息传来，渤健和卫材联合开发的抗体药物aducanumab近期被FDA有条件批准上市，从而改变了AD治疗近二十年来没有产品获批的情况，也让CNS药物研发受到了新一轮的广泛关注。
临床方案的设计较为困难，以及临床效果较难评测，缺乏跟疾病相关的生物标记物（biomarker）。精神类疾病表征不够明显，有些甚至没有明显的器质病变，而病人自己汇报的感受往往过于主观，不够准确。
副作用明显。CNS药物常常伴随着较明显的副作用，例如治疗抑郁症的药物，会引起高血压、自杀倾向等副作用。近几年多个“明星”新药因为其副作用过大而无法通过审批。
但值得欣慰的是，尽管CNS药物的开发面临诸多挑战，也还是有一大批坚守者们继续在这个领域耕耘着，除了国际知名大药企Biogen、Lilly、BI等，国内也有越来越多的药企进入到了CNS领域，比如专注于原发性脑瘤/肿瘤脑转移药物开发的赞荣医药和壁辰医药，以及植根于CNS药物开发的恩华药业等。
血脑屏障简介
如前所述，1895年埃尔里希博士在研究染料时意外发现了“血脑屏障”现象，他与其学生埃德温·戈德曼将蓝色染料通过静脉注入动物体内后发现，除了大脑外几乎所有器官都变成了蓝色。随后其他科学家于1900年也观察到了类似的现象，并首次提出了 “血脑屏障”这一概念。
后来又经过近20年的研究，对于脑部和外周组织间存在血脑屏障这一事实基本上得到广泛认可，但当时还没人知道形成该屏障的原因，直到上世纪 60 年代电子显微镜的出现，科学家能够直接观察到所谓的血脑屏障。下面列举了血脑屏障发现史上的一些里程
首次发现外周静脉注射药物后药物分子无法到达大脑 (1885)
首次提出“血脑屏障”障这一概念 (1900)
鞘内注射药物后药物分子能到达大脑，拓展了最初的“血脑屏障”概念，并首次提出“脑脊液”假说，即鞘内给药后药物分子是通过脑脊液进入大脑的 (1913)
首次发现在脑部疾病中显示出“血脑屏障缺陷”，即在颈动脉内施用高渗溶液后表现出短暂的血脑屏障打开或破坏(1941)
电子显微镜研究表明,皮层中存在细胞外液 (1966)
发现脑血管内皮细胞之间的“紧密连接”在血脑屏障中的重要作用 (1967)
采用放射性同位素标记物首次发现己糖、氨基酸和胺等能透过血脑屏障 (1971)
血脑屏障的分子生物学研究：葡萄糖转运蛋白基因的克隆与测序 (1989)
血脑屏障（Brain-blood barrier，简称“BBB”）指的是脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血液与脑组织之间的屏障，它由脑微血管内皮细胞、内皮细胞紧密连接、神经胶质细胞、星形胶质细胞、周细胞、基膜等组分构成。脑毛细血管内皮细胞排列紧密，通常只允许气体分子及相对分子质量较小的脂溶性分子通过，此种特性很好地维护了脑内环境稳态。但遗憾的是，它同样也是治疗药物进入大脑内部的一个主要障碍，使大部分治疗中枢神经系统CNS疾病的药物无法穿过BBB 在脑内达到有效治疗浓度。
药物分子进入脑实质主要通过以下途径：一是被动扩散，大部分小分子化合物都是通过这一途径透过BBB从而实现入脑，但其可能受主动外排的限制；二是通过细胞间隙入脑，该方式通常只能对一些极性低分子量的化合物适用；三是由脑内皮细胞表达的转运蛋白介导的摄取；四是由脑内皮细胞表达的受体蛋白介导的转运。
BBB的另一个重要特点是在脑毛细血管内皮细胞膜上含有多种物质转运蛋白，它们大都与脑营养物质的跨膜转运有关，如葡萄糖转运体、肽转运体、转铁蛋白受体等，它们为外周血液与脑内物质交换提供了必要条件。体内生理生化环境改变可能影响这些蛋白的表达或功能，反之，这些转运体的表达或者功能异常，也会对脑乃至整个机体功能产生影响，甚至诱发严重疾病。一些治疗脑病的药物BBB透过率低，容易耐药等情况可通过调控这些转运体的功能或表达，或者通过药物结构修饰及改造，增加药物与这些转运体的亲和力，由此来增加药物的脑内分布。
同时，BBB实现其阻止外来有害物质进入脑实质的另一个重要因素是BBB相关外排转运体的参与。外排型转运蛋白是指位于细胞生物膜上的具有将分子从细胞内外排到细胞外的转运体，已知的具有外排作用的转运体有P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白 (MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和肺耐药蛋白(LRP)等。这些蛋白广泛分布于正常组织中，如脑、肝、肾、肠、胰等，具有分泌与排泄功能的组织，并且在血脑屏障、血睾屏障和血胎屏障中发挥重要的屏障作用。
疾病对血脑屏障的影响
在介绍血脑屏障里程碑事件的时候已经提到疾病状态对BBB会产生影响，即在颈动脉内施用高渗溶液后表现出短暂的血脑屏障打开或破坏。下面总结了常见CNS疾病对于BBB 的影响：
阿尔茨海默症(AD)：紧密结合(TJ)异常，渗透性增加；P-gp表达下降，BBB渗漏(CSF中白蛋白含量增高）
帕金森症(PD)：紧密结合(TJ)蛋白降低；P-gp mRNA表达下降；MRP2表达上升
癫痫(Epilepsy)：紧密结合(TJ)蛋白降低，TJ打开；P-gp、MRP1、MRP2以及BCRP表达升高
多发性硬化症(MS)：紧密结合(TJ)蛋白降低；BBB渗漏；P-gp、MRP1、MRP2以及BCRP表达下降
衰老(Aging)：局部CBF下降；P-gp表达下降
原发性/转移性脑瘤：BBB渗漏
可以看到上述所总结的疾病绝大部分都能降低或者破坏BBB的完整性，比如通过降低紧密结合蛋白和P-gp的表达，或者直接造成BBB发生渗漏，因此可以很自然地想到BBB对于药物分子的透过性在这些病人上实际是要更大一些的，也确实在临床上可以观察到相对于动物模型上推测出来的药物入脑能力，药物在病人脑部的暴露量会更高。
例如，在发生脑转移的乳腺癌患者中发现拉帕替尼（为P-gp和BCRP底物，但其在高浓度下又可抑制这两种外排转运体）也有较高的脑部暴露量，PET研究也表明，发生肿瘤转移的脑部拉帕替尼的水平高于正常脑。此外，一些大分子抗体药物（例如抗肿瘤药物赫赛汀）也能在脑转移病人的脑脊液中检测到，蓄积也更高，也进一步说明脑部肿瘤会破坏BBB的完整性。
基于这个现象，可以推测对于入脑药物的开发，其临床前评价标准可以降低一些。例 如一般对于入脑化合物要求其临床前动物上Kp,uu（即游离药物在脑部和血液的比值，该值为1说明药物能自由从血液进入大脑，该值为0说明血液中的药物分子无法进入大脑)大于0.5，当然这个数值各个公司会有不一样，但总体原则是越接近1越好，至少应大于 0.3。
而目前临床前试验在测定Kp,uu的时候，用的都是健康动物，其BBB是完整的。因此相对于临床实际，其对于化合物入脑的限制是更为严格的，因此应考虑适当降低临床前的要求，比如设为0.2或者更低。
血脑屏障的种属差异
在新药研发中选择合适的动物模型对于药物评价有着至关重要的作用，因此从转化的角度去分析种属差异就显得十分必要。如在筛选入脑化合物的时候，大鼠实验是最常用到的动物模型，通过比较化合物在大脑与血液的浓度比值来判断其入脑程度。如果化合物 的被动扩散较好，也并非人P-gp底物，但在该模型中并未发现在大鼠中有足够的脑部暴 露，很可能的原因是该化合物是大鼠P-gp底物，却并非人的P-gp底物。
CNS药物穿透血脑屏障策略
1、小分子药物
根据BBB的生理结构，其实比较容易推出入脑小分子化合物的一些基本理化性质要求，比如亲脂性高、分子量不能太大、电负性低等，这些特性都是为了保证药物分子能较为容易地自由透过BBB。曾有科学家总结了48个CNS和45个非CNS小分子化合物的理化性质方面的区别，可看到脂溶性、氢键供体数以及可旋转键数上两类化合物有显著性区别，脂溶性方面CNS药物对比非CNS类更高。同时，与理论相符的是CNS药物的渗透性更高，是P-gp底物的概率也更低。
|
理化性质 |
CNS |
Non-CNS |
|
|
分子量 |
319 |
330 |
97 |
|
被动扩散渗透系数 |
474 |
331 |
143 |
|
%P-gp底物比率 |
15 |
42 |
35 |
|
CLogP |
3.43 |
2.78 |
123 |
|
CLogD |
2.08 |
1.07 |
194 |
|
PSA |
40.5 |
56.1 |
72 |
|
氢键供体数 |
0.85 |
1.56 |
54 |
|
氢键受体数 |
3.56 |
4.51 |
79 |
|
可旋转键数 |
1.27 |
2.18 |
58 |
|
芳香环数 |
1.92 |
1.93 |
99 |
BBB的生理结构导致其致密度较高而渗透性较差，因此要求化合物的渗透性或者说透膜性更强。对于口服药物，要求其能够穿过肠细胞膜后到达全身血液系统。相对于药物分子在肠道的渗透性，对其在BBB的要求就更高了，原因在于：一是相对于肠道，血管-大脑药物浓度梯度低很多；二是大脑的蛋白结合率一般来说相对更高；三是相对于其他组织，因为有TJ存在，药物分子在脑部血管缺乏细胞间转运，同时也缺乏具有空隙的毛细血管；四是药物分子在脑部的血管滞留时间更短，一般以秒计。
在非外排转运体底物方面，之前介绍过在BBB上高表达的P-gp和BCRP等外排转运体是导致很多药物分子（例如化疗药）无法穿过BBB进入大脑的原因，因此在早期药物筛选中需要剔除掉这类外排转运体底物的化合物分子。评价药物分子是否为外排转运体的底物，通常会用外排率（Efflux ratio,ER）来评价。以P-gp为例，如果ER高于2说明化合物是该转运体的底物。
以奥希替尼(Osimertinib)作为实例，作为第三代EGFR抑制剂，能克服第一代出现的T790M耐药，目前已经广泛用于一线以及二线EGFR突变的非小细胞肺癌治疗，其在脑转移病人上也取得了良好的效果。下表总结了不同EGFR抑制剂在小鼠模型上的入脑情况，可以看到相对于一代吉非替尼、二代阿法替尼和三代Rociletinib，奥西替尼表现出更为出色的入脑能力，其最高浓度(Cmax)下的Kp可以达到3.41，为吉非替尼十数倍。
|
Osimertinib |
Gefitinib |
Rociletinib |
|
|
Dose(mpk) |
25 |
6.25 |
100 |
|
Plasma Cmax(μM) |
0.82 |
0.82 |
3.32 |
|
Brain Cmax(μM) |
2.78 |
0.17 |
BLQ |
|
|
3.41 |
0.21 |
<0.08 |
同时，尽管在临床前动物模型中吉非替尼和阿法替尼都并未发现有理想的入脑能力 (Kp<0.25)，但从绝对数值上看吉非替尼的表现还是优于阿法替尼的。临床研究也证实了这点，吉非替尼和另一个一代EGFR抑制剂厄洛替尼的脑部的药物浓度远高于阿法替尼。药物的入脑情况也如预期体现在了临床疗效上，阿法替尼在脑转移病人上的疗效低于入脑能力更强的吉非替尼和厄洛替尼，如响应率35%vs80%，无进展生存期4个月vs>6个月，尽管不同的研究这样直接比较临床疗效是不够准确的，但还是能看出对脑肿瘤大致的疗效区别。
前面也提到脑部肿瘤对于BBB的破坏，所以尽管吉非替尼并未在临床前表现出能达到CNS药物的标准，其在临床上还是被证明能给脑转移病人带来获益，当然相对于奥西替尼药来说临床疗效要差一些。
2、通过转运体/受体介导的入脑
除了开发能直接透过BBB化合物分子外，研究人员也希望通过脑血管表面的转运体/受体介导药物转运来提高脑组织中药物浓度。研究发现，在脑血管内皮细胞上存在多种转运体和受体，如转铁蛋白受体和胰岛素受体等。
之前基于提高BBB渗透率的药物开发策略其效果并不理想，因此使用血脑屏障内源转运系统看似是一种合理的手段，这种方法可以用来调控药物的转运，且不破坏BBB完整性。依照类型，内源性血脑屏障转运系统可分为：载体转运、主动运输和受体介导转运。其中，载体转运体和主动运输体系统负责血液和脑组织之间小分子运输（如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）；受体介导转运体系统负责特定内源性大分子的跨血脑屏障转运（如胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白等）。
血液系统中的分子可以与BBB表面特定受体结合，结合后通过受体介导作用，复合体分子穿过血管内皮细胞进入大脑。这被认为是针对脑靶向药物递送的最成熟的策略之一，具有高特异性、选择性和亲和力的特点。
3、单抗穿透BBB
艾伯维德国研发中心主管翰恩博士曾说“仅仅低于5%的小分子药物可以穿透血脑屏障，生物药物几乎不可能穿透血脑屏障”。相对于小分子化合物，像单抗这类分子量巨大的药物是无法直接穿过BBB到达脑部的，因此对于CNS抗体类药物的开发，其主要策略是：一是间接发挥疗效，例如单抗多发性硬化症(MS)上的治疗一般都是通过抑制外周免疫反应而实现的；二是通过表达在BBB上的受体内吞，设计双靶点抗体(Bi-specific antibody)，即一段靶向BBB上的转运蛋白或受体，另一端靶向疾病靶点。
最近单抗药物在AD治疗上有巨大的突破，即抗β-淀粉样蛋白抗体aducanumab被FDA 有条件批准上市，尽管对其疗效还存在较大的争议。据报道，aducanumab区别于其他临床失败的amyloid beta抗体在于其天然就能够跨越血脑屏障进入脑实质，但具体原因还未 知，有可能是高浓度的抗体药物能直接破坏BBB的完整性。
4、药物入脑预测
对CNS药物是有着巨大临床需求的，但困难是CNS药物研发挑战性很大，其中一个需要解决的问题就是如何找到一种方法能在临床前对CNS药物的作用进行准确预测。目前来说我们对于精确预测CNS药物作用的认识还存在很多空白，也缺乏对脑部药物分布的充分了解。
未来展望
为使更多的药物能进人脑组织并发挥更好的疗效，研究人员采取了多种方法来增加药物对BBB的通透性。用于临床治疗的第一个方法是BBB破坏法，即颈内动脉注射高渗糖溶液，通过渗透作用吸出脑血管内皮细胞中的水分使其收缩，从而使BBB通透性增加。但该方法具有侵袭性，即使在周围血循环中无毒的白蛋白进入脑组织后也会引起严重的后果，也因其副作用大而逐渐退出了大众视野。
受体和载体介导药物转运的优点是其能采取灵活的治疗方案，但由于受到治疗药物能否与受体和载体特异性结合，以及受体和载体的数量及转运能力的限制，目前仅有很少一部分治疗药物可通过这一方法转运到脑组织，但该领域的研究也还是受到了广泛关注。
另外需要特别强调的是，对于CNS疾病的治疗不应把思路局限在药物分子一定要透过BBB才能发挥药效这个假设上，就如前文提到的很多大分子抗体药物其实是作用于外周靶标从而间接治疗脑部疾病的，再举一个目前CNS领域可以说是讨论得最为火热的例子：绿谷制药的抗AD药物“GV-971”，一种来源于海藻的寡糖类药物，因其分子量大以及极性高等特征，理论上是无法穿过BBB到达大脑的。因此，在其发挥疗效的机制研究上，研究人员另辟蹊径从肠道微生物的角度对其进行了研究，最终也确实找到了能够很好支撑其疗效的理论依据。
最后，随着生物技术的蓬勃发展，老的机理也越来越多地被发现是错误的或者不是唯一的，典型的例子就如数十年的糖尿病老药二甲双胍近年来不断被发现在新适应症上的应用，而肠道菌群、免疫反应等新兴研究也有望开辟新的药物研发方向。因此，可以说对 于生物体的探索永远都是没有尽头的，相信在科研工作者的努力下，CNS疾病缺医少药 的困境会逐步得到改善。
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