苹果小卷蛾长非编码RNA的鉴定

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下面是100个lncRNA组装案例文献分享

标题：The landscape of lncRNAs in Cydia pomonella provides insights into their signatures and potential roles in transcriptional regulation

标题：苹果小卷蛾中lncRNA的特征及lncRNA在转录调节过程中的作用

杂志：BMC Genomics

通讯作者：Wei Fan,1  Fanghao Wan,1,2  Wanqiang 1

机构：1中国农业科学院 深圳农业基因组学研究所 深圳分院，广东省岭南现代农业实验室，农业部基因组分析实验室，深圳 ，2 中国农业科学院 植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京

文章链接：doi: 10.1186/s12864-020-07313-3

发布时间：Published online 2021 Jan 5

摘要：苹果小卷蛾（Cydia pomonella L.）是我国重要的入侵物种；然而，lncRNAs在这种昆虫中的功能影响尚不清楚。在这项研究中，基于公开的RNA-seq数据集，构建了一份蛾类的lncRNAs图谱。

共鉴定出9161个位点编码的9875个lncRNA转录本。

正如预期的那样，lncRNAs显示出比蛋白编码基因(PCGs)更短的转录本长度，更低的GC含量和更低的表达水平。此外，与PCG相比，lncRNA更有可能表现出组织特异性的表达模式。此外，保守性分析表明，lncRNA序列在昆虫间的保守性很弱，但基于共线性可以识别出更多同源的lncRNAs，这表明共线性可能是一种更可靠的跨物种比较lncRNAs的方法。此外，lncRNAs与相邻PCG的相关性分析表明，它们之间存在较强的相关性，表明这些lncRNAs在基因表达调控中具有潜在的顺式作用。

该研究为lncRNAs的比较和功能研究提供了有价值的资源，这将有助于理解它们在转录调控中的机制作用。

关键词：长非编码RNA，保守性，共线性，转录调控，苹果小卷蛾

材料方法：

数据：14个样本（雌头、雄头、雌性中肠、雄性中肠、睾丸、卵巢、附腺) 各两个生物重复的样本；SRP083782(SRR4101328-SRR4101341)

2个没有生物学重复的样本（雄性和雌性触角）SRP060413 (SRX1082030, SRX1082029)

5个不同发育期的样本（2个胚胎期，幼虫期、蛹期、成虫期各1个）SRP181710 (SRR8479435, SRR8479438,SRR8479439, SRR8479440, SRR8479441)

1.转录本组装：

  • 质控：FastQC：
  • 过滤：Trimmomatic v1.3
  • 比对：GSNAP version 2019-06-10
  • 组装：StringTie v1.3.3b
  • 转录本分类：gffcompare v0.10.1

2.lncRNA鉴定：

  • 转录本类型：u i x
  • 长度大于200nt
  • 至少有两个外显子
  • CPC CNCI 不具备编码能力
  • ORF小于300nt
  • BLASTX比对到SwissProt ，无显著匹配 E-value = 1e-3
  • Pfam无显著匹配（E-value = 1e-3）
  • RPKM >1

3.组织特异性表达的转录本分析

为了衡量每个基因的组织特异性水平，我们计算了JS散度分数，作为跨九个不同组织或五个发育阶段的特异性指数。对于每组，我们计算所有重复的平均值，并计算JS得分。一般来说，JS评分范围在0到1之间，值越大，表明基因的特异性越高。

为了避免受到表达量水平的干扰，编码基因和LncRNA根据每个基因在9个样本中的最大RPKM值被分为三组(低：RPKMmax<5.0；中等：5.0≤RPKMmax<50.0；PRKMmax≥5 0.0)，并分别计算3组的JS评分。先前的一项基准研究表明，tau指数是衡量基因表达的组织特异性的良好指标。

4.转录本丰度评估与差异表达分析

To estimate the expression levels of PCGs and lncRNAs, HTSeq v0.10.0

  • 差异分析DESeq2  p-value < 0.05 and a |log2fold-change| ≥ 1.0

5.序列保守性分析

与7个具有代表性的昆虫进行比对。A. aegypti  A. gambiae   B. mori   N. lugens    P. xylostella  A. mellifera  D. melanogaster

6.lncRNA同源性分析

Python pipeline https://github.com/Gabaldonlab/Synthenic-Families

比较了家蚕和蛾之间的lncRNA。

7.LncRNAs与邻近PCG的相关性分析

使用lncRNA上下游10kb的编码基因的RPKM计算PCC。

8.富集分析

GO  q-values < 0.05

结果

1.在苹果小卷蛾中鉴定到9875个lncRNA

9875 个lncRNAs 9161 个位点。下图A为鉴定 到的 lncRNA类型。B是其他昆虫中lncRNA的鉴定情况，做了下比较。

在大多数物种中，基因间区的lncRNA占大多数。

2.lncRNA的特征描述

  • lncRNA转录本长度小于mRNA
  • lncRNA主要含有2个外显子
  • lncRNA GC含量低于mRNA
  • lncNATs的表达水平略高于mRNAs。
  • 共有11782个PCG与先前预测的TES重叠，占所有PCG的53.16%。相比之下，与TE重叠的lncRNAs比例明显更高(9875个中的7786个，78.85%)
  • 对于lncRNA，大部分重叠的TES被归类为未知。Lines、RC/Helitrons和DNA转座子是lncRNA前三个TES。另一方面，SINES和LTRS很少与lncRNAs相关

3.lncRNA在不同发育期和不同组织的表达模式

睾丸、雌性触角和附腺是表达最特异的lncRNAs的前三个组织。附腺和睾丸是特异性分数最高的组织。相比之下，卵巢的特异性得分最低。总的来说，，lncRNAs表现出比mRNAs更显著的时空特异性表达模式。

4.lncRNA的差异表达和性别偏向表达模式

lncRNA更加偏好雄性表达。这个差异分析比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；

5.lncRNA的同源关系基于共线性而不是序列保守性

LncRNAs在昆虫物种间表现出很弱的序列保守性，特别是对于进化距离较远的昆虫。

6.lncRNA与邻近编码基因更高的相关性

大量lncRNA的功能是未知的，但是它们主要是cis-regulators，所以可以根据它们临近的蛋白编码基因功能来近似推断，然后表达量的相关性也可以类推到。

  • 根据位置关系推断 使用bedtools等工具！

  • 表达量的相关性， 比如杂志Cancer Medicine, 2020的文章《 Genome-wide DNA methylation analysis by MethylRad and the transcriptome profiles reveal the potential cancer-related lncRNAs in colon cancer》，在进行结直肠癌相关lncRNA的功能富集分析，就是采用LncRN2Target v2.0和StarBase分析与15个lncRNA共表达的蛋白编码基因，其中lncRNA HULC和ZNF667-AS1分别鉴定到28个、9个共表达的蛋白编码基因！

大多数(6831，69.17%)的lncRNA具有相邻的编码基因。共有3199对LncRNA编码基因(GP)的PCC绝对值>0.5，这些LncRNA代表了潜在的具有顺式调控功能的候选基因。

大比例的lncRNAs与邻近的PCG显示出更强的相关性，并可能在基因表达的调控中发挥顺式作用。

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