活体成像要做好，标记方法很重要
生物发光与荧光的标记原理
图1 生物发光与荧光反应原理
生物发光标记是用基因工程的技术将荧光素酶（luciferase）基因标记到细胞或DNA上，再将改造过的细胞或DNA植入动物体内；而荧光技术则采用荧光蛋白、染料、纳米材料（GFP、RFP、dyes等）标记研究对象来进行活体观察（图1）。两种标记方法具有各自的特点（表1）。
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生物发光 |
荧光 |
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优点 |
特异性强 |
信号强度高 |
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灵敏度高 |
荧光蛋白及染料选择多样 |
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定量准确 |
活体动物、组织器官均可成像 |
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缺点 |
对检测设备要求高 |
非特异性荧光限制了灵敏度 |
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细胞或基因需要标记，操作复杂 |
需要不同波长的激发光 |
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很难应用于人体 |
很难准确定量 |
表1 生物发光与荧光反应原理
在现代生物医学研究中，荧光由于在多领域的应用广泛，而被大家普遍认可。然后在活体成像的实验过程中，当两种方法都适用于研究对象时，我们更推荐利用生物发光的标记方法来开展成像实验。
两种标记方法大PK
在活体成像的过程中，荧光标记存在一个极大的弊端。
图2 生物体自发荧光图谱
荧光的发光过程，需要外界激发光源的激发。生物体内很多物质，如皮肤、毛发、血液及各种组织，当遇到光源激发时，都会产生自体荧光（图2）。这种非特异性的自体荧光，在可见光400-500nm区间内最为突出，随着激发波长的增加，荧光强度会逐渐减弱。而生物发光的过程是酶与底物结合的酶促反应，光源来自于动物体内，因此不存在背景干扰。
图3 生物发光与荧光标记比较
以图3为例，荧光信号强度是生物发光信号的100倍，但是由于非特异性荧光产生的背景噪音，使其信噪比远远低于生物发光，仅为生物发光的千分之一。这些背景噪音造成了荧光成像低灵敏度的特点。另外，由于荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，因此生物发光信号可以用于精确定量。而荧光信号水平取决于体内光源强度、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。基于上述原因，大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。
活体成像标记注意事项
生物发光标记
生物发光标记的关键步骤在于荧光素酶基因的转染效率。在种植细胞之前，首先要进行体外实验来测试荧光素酶的转染和表达效率（图4）。将构建的细胞以倍比稀释的方法铺于96孔板中，然后进行生物发光的定量分析，计算单个细胞单位时间发出的光子数，当数值介于100-1000之间时，适合进行体内实验，数值过低或过高，都不适合体内成像或长期观测。将定量数据绘制标准曲线，计算标准差，线性好证明细胞表达稳定，线性差则表明荧光素酶表达不稳定，同样不适合进行体内实验。
图4 生物发光标记体外实验
荧光标记
虽然生物发光在活体成像领域具有诸多优势，但是有些物质，例如蛋白、纳米材料、小分子化合物等，不能使用生物发光技术进行标记，这时荧光标记依然可以发挥长处。
图5 光在生物体内的穿透性
如图5所示，光在生物体内的穿透性会随着波长的增加而逐渐增强，结合生物体自发荧光的影响，我们建议选择激发光波长在650nm以上的荧光进行标记，以期获得理想的活体成像图像。
进行荧光成像时，还应注意两类常见的干扰因素：
图6 毛发对于活体成像信号的影响
利用有毛的实验动物进行活体成像时，毛发不仅会产生自体荧光，而且会对体内的标记光源有一定的吸收（图6），因此在成像之前建议采取脱毛处理的方法来减少干扰；
图7 饲料对于活体成像图像的影响
动物饲料中常含有一些荧光物质，在特定的波长下会对成像产生干扰（图7）。当研究对象是消化系统时，建议对实验动物采取禁食处理或选择不含有荧光物质的特殊饲料。
除了上面两种标记方法以外，任何可以发光的物质都能应用到活体成像上，曾有研究人员利用核素标记来检测β粒子发出的蓝光。因此，选择哪一种标记方法，取决于研究者实验的要求。小伙伴们，你们选好了吗？
参考文献
1. Troy T, Jekic-McMullen D, Sambucetti L, Rice B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal Models。Mol Imaging. 2004 Jan; 3(1):9-23.
2. 张怡，韩彧，赵春林. 活体动物体内光学成像技术的研究进展. 2006，18（1）