鞘氨醇（Sph）和二氢（神经）鞘氨醇（Spa）是一种单链鞘脂，它们不仅充当复杂鞘脂的骨架，还具有生物信号传导功能，在细胞功能和疾病（例如癌症和尼曼-匹克氏病C型）中扮演着重要角色。不幸的是，由于缺乏在活细胞中对鞘氨醇进行成像和检测的技术，探究鞘氨醇在生物学和疾病中的功能和行为具有一定的困难。近年来，荧光标记的脂质已间接用于研究鞘脂在细胞中的定位，但无法提供有关内源性脂质浓度的信息。因此，开发在活细胞中检测和成像鞘氨醇的方法显得尤为重要。基于此，美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校Neal K. Devaraj教授课题组开发了一种小分子荧光开启探针，用于标记活细胞中的鞘氨醇。该探针表现出对鞘氨醇的剂量依赖性反应，并且能够检测内源性鞘氨醇。另外，作者基于该探针成功地证明了尼曼-匹克氏病C1型（NPC1）患者中鞘氨醇在细胞中的蓄积。相关成果以“A Small Molecule Fluorogenic Probe for the Detection of Sphingosinein Living Cells”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.0c06652）。首先，基于脂肪酸水杨醛酯和1,2-氨基醇（Sph和Spa中存在）可以在生物条件下选择性反应，作者假设水杨醛的荧光团酯可以用于构建检测内源性Sph和Spa的探针，且利用荧光淬灭基团使探针不产生荧光。探针与Sph或Spa反应后，荧光团将从水杨醛转移至鞘脂碱基，同时其与淬灭剂的亲和性降低而产生荧光（Figure 1A）。作者选择Bodipy FL作为荧光团，选择Black Hole Quencher-1（BHQ-1）作为淬灭剂进行探针设计。探针1的反应性核心为4-二烷基胺官能团类似物（Figure 1B）。此外，作者合成了一个与1相同的对照探针2，只是它缺少与末端1,2-氨基醇基团选择性反应所必需的醛，因此不会与细胞中的鞘脂碱基反应。接下来，作者在鞘脂碱基和潜在竞争生物分子存在的情况下，定量研究了1的荧光开启。当1（5 μM）与Sph（0.25 mM）或Spa（0.25 mM）在37 ℃下孵育24 h时，作者观察到3倍和2.5倍的荧光开启。但是，当在相同条件下将1与丝氨酸（2.50 mM）或鞘氨醇1-磷酸（Sph1P）（0.25 mM）孵育时，荧光强度没有变化（Figure 1C），表明探针1具有良好的选择性。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
随后，为了确定1是否可以与活细胞中的Sph反应，作者将1（7.5 μM）与HeLa细胞孵育2 h，然后将细胞培养基换为含有不同浓度Sph的新培养基。结果发现，在孵育20 h后，经外源Sph处理的细胞显示出剂量依赖性的荧光增强（Figure 2A, B）。另外，作者用2进行了相同的实验，发现未处理的对照组与用Sph处理的细胞之间的荧光并没有显著的差异（Figure 2A, C）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
最后，作者将探针应用于细胞内鞘氨醇水平的检测。作者用1或2（20 μM）处理HeLa细胞，并进行孵育前和孵育16 h后的成像研究，发现经1处理的细胞中很容易检测到荧光增强信号（17.4％）（Figure 3A），而经2处理的细胞仅显示出细微的荧光增强信号（4.7％）（Figure 3A, B）。以上结果表明1用来检测天然鞘氨醇的时候具有高敏感性，可用于探究细胞中鞘氨醇水平的差异。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
NPC1是一种由NPC1基因突变引起的溶酶体贮积病，在NPC1突变时，它会导致几种脂质（包括鞘氨醇）的积累。为了研究1是否可以用于检测NPC1患者中鞘氨醇的积累，作者培养了来自健康人群以及NPC1患者的成纤维细胞。用1（7.5 μM）孵育细胞24 h后，作者观察到NPC1细胞显示出更强的荧光信号（Figure 4）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
总而言之，作者设计并合成了一种用于活细胞中Sph检测的荧光探针。该探针可结合荧光显微成像技术对哺乳动物细胞中的Sph进行浓度检测，并有望成为NPC1和戈谢病（Gaucher disease）等脂质沉积障碍疾病的诊断工具，推动了生物学研究。
