Nat Can | CAR T细胞扩增能力决定长期治疗有效性
撰文：风不止步
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亮点：
IS分析数据可能有助于识别有早期CAR - T细胞丢失风险的患者，并强调T记忆干细胞在介导早期抗白血病反应和CAR - T细胞长期监测中的关键作用。
2021年5月24日，美国生物医学成像中心的Persis J. Amrolia等人在《Nature Cancer》上发表了一篇“Clonal expansion of T memory stem cells determines early anti-leukemic responses and long-term CAR T cell persistence in patients ”的文章。研究表明，通过整合位点分析可以跟踪低亲和力CD19嵌合抗原受体(CAR) T细胞的扩增和持久性，作者发现早期(1个月)和晚期(>3年)时间点的整合位点分别聚集在一起，表明不同的克隆对早期反应和延长的抗白血病监测有不同的贡献。对CAR - T细胞产物和注射后的共享整合物的分析表明，尽管频率很低，但T记忆干细胞克隆在早期扩展和长期持续期间对循环的CAR - T细胞池有很大的贡献。IS分析数据可能有助于识别有早期CAR - T细胞丢失风险的患者，并强调T记忆干细胞在介导早期抗白血病反应和CAR - T细胞长期监测中的关键作用。
CD19 CAR T细胞在复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）中显示出前所未有的反应。抗白血病反应与早期CAR T细胞扩增的水平和CAR T细胞植入的持续时间都相关，如果用作独立疗法，则其长期持久性至关重要。IS分析可追踪患者中基因修饰的CAR T细胞的克隆动态，因为每个转导的细胞均由充当遗传条形码的载体IS稳定标记。使用改良的低亲和力CD19 CAR可提高输注后CAR T细胞的扩增和持久性，第一次能够通过流式细胞术检测并选择长期持续存在的CAR T细胞。通过将治疗后的表型分析与所选CAR T细胞的高分辨率IS分析相结合，分析了两名患者外周血中长期存在持久性CAR T细胞的输注CAR T细胞的命运（图1a）。
对患者中CAR T细胞进行了全面的免疫表型分析，以检测CAR细胞和表征不同的T细胞亚型（图1b，c）。通过流式细胞术评估了输注产品和输注后外周血中CAR T细胞的初始/记忆表型。在长期存在CAR T细胞持久性的患者中，注入的CAR T细胞产物主要由TCM（CAR T细胞的78–81％）组成，而TEM的贡献较低（17–21％），但是一个很小但可检测的TSCM池（1-2％）（图1f）。
接下来在单克隆水平上表征了患者的CAR T细胞以解决：（1）在急性抗肿瘤反应阶段相对于稳态期间，CAR T细胞的克隆动态是什么？（2）长期存活的CAR T细胞的克隆组成是什么？并且，（3）在这些患者中，哪一部分细胞产物对CAR细胞的长期维护贡献最大？为解决问题，已建立完善的方案，将血细胞亚群的FACS，全基因组扩增，线性扩增介导的PCR和高通量测序相结合，从TSCM中收集IS。尽管输注后克隆多样性有所降低，但CAR T细胞即使在术后后期仍保持高度多克隆性。然后，分析了输注产物和分离的输注后早期和晚期时间点在CAR T细胞基因组中IS的分布。
然后，通过从FACS分选的TSCM，TCM或TEM细胞开始收集的IS的数量和相对贡献来评估CAR T产品中CAR T细胞的多样性。所有亚群在患者4和6中均表现出高度多样性，最大的克隆范围为每个人群的2.1％至14.7％（除了一个带有IS的克隆占从Pt6 TEM收集的读数的30.4％之外）。值得注意的是，与其他两个人群相比，两个人的TCM分数都显示出更高的整合数和更高的多样性。比较了在相同时间点分选的CAR TSCM细胞与其余CAR群体的IS谱。观察到，在这两个患者中，TSCM的克隆多样性在早期响应阶段显着下降。该观察结果可能反映了在早期反应阶段TSCM细胞中发生了真正的克隆爆发和寡克隆扩增（图2）。在相同的时间点，尽管从输注发生了从TCM到TEM表型的重大转变，其余CAR细胞的克隆组成（TCM / TEM）仍然是高度多克隆的。这表明，与TSCM对应物相比，在这些患者中注入的CAR TCM和TEM细胞以更“稳态”的方式扩增。
为研究CAR T细胞随时间的克隆动力学，首先比较了早期或晚期时间点的所有数据集，并根据IS相似性进行了无监督聚类（图3a）。发现在早期反应阶段活跃的克隆在之后的较晚时间被捕获的可能性较小。结果表明，输注后直至24/28个月，仍约有34,000和55,000个CAR克隆仍在Pt4和Pt6中流通（图3b）。然后，评估早期时间点观察到的扩展TSCM克隆的重新捕获概率。相反，这些大的克隆似乎对长期生存的CAR T细胞没有实质性贡献（图3c）。总体而言，在早期反应阶段或长期持续的CAR T细胞中，没有证据表明插入诱变会导致这些患者中CAR T细胞的克隆选择。
最后，与Pt10和Pt17的结果进行了比较。检索到的独特IS的数量与在Pt4和Pt6中看到的数量大致相似。首先测量了每种IS的相对丰度（图4a），并分析了来自CAR T细胞产物和治疗后分选出的CAR群体的克隆多样性。与长期生存的CAR T细胞患者相比，这些个体在组成药物产品的所有人群中总体显示出较低的克隆多样性水。输液后，可以在第一个月再次观察到CAR TSCM细胞的克隆爆发。然而，与长期存在CAR T细胞的患者相反，这些患者在CAR T细胞消失之前的第一个月中，TCM / TEM区室的多样性迅速下降（图4b）。
观察到长期存活的CAR群体由大量稳定大小相等的克隆组成，研究了是否可以在细胞产物的IS和输注后检测到的IS之间建立联系。了解输注后哪些CAR T细胞亚型引起早期扩增和长期持续的CAR T细胞。第一次了解到在输注前后采集的样本中有大量相同的IS，在输注后的不同时间点获得的CAR T细胞产物子集和样品之间的IS共享。在细胞产物和晚期时间点之间检测到相同的IS，但IS数量仍不足以达到显着水平。当考虑与TCM或TEM细胞相比，输注时观察到的TSCM细胞频率极低（占总CAR T细胞的1-2％）时，这种贡献尤其重要。
总之，通过结合免疫表型分析和分子跟踪，已经获得了对介导初始反应的早期扩增的CAR T细胞以及长期存活的CAR T细胞的性质和动力学的重要了解，该CAR T细胞可为两名患者提供针对白血病复发的免疫监测输注后长达3年。IS检索方法已被小组和其他人员广泛用作跟踪克隆的可靠方法，与高通量TCR测序相比具有更高的价值。这是因为即使在载体阴性细胞群中高度稀释的工程化T细胞克隆，仍可以特异性地追踪工程化T细胞克隆；提供了一组稳定的基因组标记，CAR T细胞显示出多克隆IS谱，并且在输注后的早期和晚期都保持克隆多样性。单个克隆随时间显示不同的扩展和收缩模式，不同的克隆负责早期扩展和长期持久性。
结果表明输注后，CAR T细胞在早期应答过程中经历了从以中医为主的快速转变为TEM表型的过程。早期丢失CAR T细胞的患者表现出更高的分化表型，TSCM细胞比例较低，TEM细胞比例较高，并且其产品的克隆多样性降低。与长期持久性相比，CAR T细胞持久性较差的患者显示出CAR TCM和TEM细胞的克隆多样性显着降低。
在具有长期CAR T细胞持久性的患者中，CAR T细胞在暴露于CD19抗原后并未最终分化为TEMRA细胞，TSCM表型变得更加普遍，同时长期保持了克隆多样性。因此，可以推测，具有稳态增殖能力的自我更新细胞（例如TSCM细胞）可支持CAR T细胞的长期维护。在输注时，属于细胞产物中的一小部分TSCM细胞的克隆在循环中的长寿命CAR T细胞库中具有最高的重新捕获概率，这是首次证明TSCM细胞在CAR T细胞长期抗白血病监测中的关键作用。
先前临床前数据表明，低亲和力CAR分子CAT-19（CAT）CAR发出的信号导致增强的CAR T细胞扩增。我们的CAR构造包含一个4–1BB共刺激域，可延长持久性。其次，生产流程相对较短（7-8天），并且没有利用培养基中的外源细胞因子，可能有助于增强早期反应。这些培养条件允许以足够大的剂量向这些患者中注入一小部分TSCM细胞，使其在最初的克隆猝发阶段中存活并长期维持CAR 细胞库。
实验数据首次为TSCM细胞在输注后介导早期抗白血病反应和CAR T细胞的长期持续存在中的关键作用提供了证据。未来将继续集中在验证更多患者队列，及改进CAR设计和制造方法以将TSCM和TCM细胞保存在注入的细胞产品中。
教授介绍
Persis Amrolia教授于1999年来到大奥蒙德街医院（GOSH）担任MRC临床科学家，并于2002年被任命为骨髓移植（BMT）的顾问，UCL的移植免疫学教授，2013年是美国国立卫生研究院（NIHR）研究教授。
Persis在世界上一些领先的血液学研究所接受了培训，包括：哈默史密斯医院，在那里他对白血病和BMT产生了兴趣；美国国立卫生研究院；美国贝塞斯达（Bethesda USA）和美国孟菲斯市圣裘德儿童医院（St Jude Children's Hospital）获得博士学位，并在贝勒医学院（Baylor College of Medicine）从事细胞和基因疗法的研究。
研究兴趣：
Persis在将尖端科学转化为患者的临床益处方面拥有出色的记录，并且在GOSH的BMT部门开发世界一流的研究计划中发挥了关键作用。
研究工作集中于免疫疗法–使用免疫细胞预防干细胞移植后的感染和白血病复发，正在用这些方法领导两项主要的临床试验，并计划进行另外两项研究。与此同时，他与GOSH BMT部门的同事们一起为免疫系统遗传疾病的儿童开创了基于抗体的新型调理方案，以减少在骨髓移植之前进行密集化疗的需要。在同行评审期刊上发表了80多篇论文，并吸引了超过900万英镑的研究经费。
参考文献
1、Luca Biasco, Natalia Izotova, Christine Rivat.et al. Clonalexpansion of T memory stem cells
determines early anti-leukemic responsesand long-term CAR T cell persistence in patients.(2021)