5.5分纯生信，类固醇表型的泛癌分析
本研究旨在提高对肾上腺皮质癌(ACC)免疫治疗途径（包括可能的药物靶点）的理解，重点在于免疫逃逸及针对ACC免疫细胞的激活，以及对没有类固醇干扰的情况下的基因表达进行分析。首先，作者基于高低类固醇表型（分别为HSP和LSP）的方法，在TCGA-ACC队列数据中探索了ACC免疫途径，并通过差异表达和富集分析探索HSP和LSP对肿瘤免疫相关性的联系。研究发现，LSP患者中存在高表达的免疫调节因子，表明这些免疫调节因子的激活可能是清除过量糖皮质激素后的重要辅助治疗目标。此外，与HSP ACC和其他癌症亚型患者相比，LSP ACC患者具有更高的免疫细胞浸润。总之，本文重点分析了LSP和HSP之间的差异，并讨论有无类固醇干扰对免疫系统的影响。
发表杂志：Front Endocrinol(Lausanne).
影响因子：5.552
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研究背景
肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见的高度侵袭性恶性肿瘤，其中>80%与类固醇生成有关。在37.6%(197/524)的ACC成人中观察到明显的皮质醇增多。另外，ACC分子变化的表型可能主要来自共同分泌的皮质醇和雄激素。类固醇组合的这些差异是定义类固醇表型和识别相关基因改变的重要基础。迄今为止，三种CpG岛高甲基化表型(CIMP)是ACC泛分子亚组最可靠的生物标志物。曾有研究将ACC mRNA-seq数据聚集在具有高类固醇表型(HSP)和低类固醇表型(LSP)的两个亚组中，分离了类固醇合成途径中基因的表达模式。
流程图：
分析解读：
免疫浸润
①研究包括来自TCGA的11080名患者，其中10448名用白细胞计数进行了注释，并按中值进行排列。
②基于Cibersort估计的免疫细胞比例乘以白细胞计数，从而得出可用于样本内和样本间比较的最终分数。
③对于ACC队列分析，CD8+TL和活化NK细胞的评分用于泛癌比较，而所有22种细胞类型的评分用于队列内分析。
④Wilcoxon检验用于比较HSP和LSP组之间的xCell和Cibersort免疫浸润评分。
⑤使用McQuitty和欧几里德距离方法以半监督方式对样本的免疫特征和细胞评分缩放数据进行聚类。
结果：白细胞计数的TCGA泛癌比较
结果：关于免疫细胞浸润的TCGA泛癌比较
下图A：CD8+T细胞和T自然杀伤(NK)细胞的xCell评分。
下图B：活化CD8+T细胞和NK细胞的Cibersort评分。
结果：HSP和LSP的主要临床特征
差异表达分析
①使用R包“TCGAbiolinks”和“SummarizedExperiment”获得78名具有类固醇表型特征的ACC患者的高通量测序(HTSeq)mRNA数据。
②使用EnsembleDb版本101过滤56457个转录本的蛋白质编码基因，并使用R包“AnnotationHub”进行标记。
③使用R包“DESeq2”对两个类固醇表型组进行差异表达分析。
④P值使用Wald检验计算，并使用“Benjamini-Hochberg”进行调整。
结果：TCGA ACC队列中的LSP与HSP差异表达分析结果
功能富集分析
①使用CERNO测试对差异表达基因进行富集分析。
结果：将CERNO测试应用于标志基因集(A)和血液转录组模块(BTM)(B)中差异表达的基因。
免疫调节因子和免疫检查点的表达
①差异表达分析结果的调整p值用于组间比较。
②R包“ComplexHeatmap”用于构建热图，计算免疫调节基因表达的列式z分数。
③对于免疫检查点基因CD8B、CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)的表达，计算Pearson相关系数和p值，并根据Fisher Z变换推断置信区间。
结果：LSP ACC中T细胞、单核细胞和细胞溶解活性的富集分析。
下图A：TCGA ACC免疫浸润的列式z分数热图。
下图B：在单核细胞、CD8+T细胞（xCell和Cibersort）、T自然杀伤(NK)细胞(xCell)和活化NK细胞(Cibersort)方面比较LSP和HSP的箱线图。
结果：
LSP与炎症免疫反应相关，HSP与淋巴细胞相关
下图A：具有按列z分数的热图，用于表达免疫调节基因。
下图B：比较LSP和HSP的白细胞部分以及与淋巴细胞浸润评分、巨噬细胞调节、伤口愈合、IFN-γ反应和TGF-β反应相关的五种免疫特征的箱线图。
ACC队列中的白细胞计数和突变
①来自cBioPorta数据库具有TP53(n=16)、CTNNB1(n=13)和MEN1(n=7)突变的ACC患者的Pan-Cancer Atlas数据与白细胞计数信息合并。
②使用Wilcoxon检验对这些驱动基因中有和没有突变的患者进行比较。
结果：
①在驱动基因中，ACC队列中发现的最常见突变是TP53(n=16)、CTNNB1(n=13)和MEN1(n=7)。
②这些突变主要存在于HSP患者中。
③无法确定白细胞部分的差异是由突变引起还是由类固醇表型引起。
免疫亚型
①数据来自iAtlas网站，选择丰度超过50%且一致性交互大于2.5的节点作为C3和C4免疫亚型。
②下载了11060个TCGA样本的批量校正和标准化基因表达矩阵。
③根据参与者条形码将矩阵与Thorsson数据集合并。基因表达数据按每个基因的计数从低到高排列，患者被分为三分位数（低、中和高）并过滤ACC患者的条形码。
结果：
下图A：iAtlas资源管理器-细胞外通讯网络。
下图B：基于泛癌比较中的基因表达水平评估网络中存在的受体和配体。
结果：CD274/PDCD1LG2和CD8B表达之间的相关性
生存分析
①ACC概况的总生存期(OS)和无进展期(PFI)的Kaplan-Meier分析。
结果：
下图A：LSP(n=31)与HSP(n=47)的OS和PFI。
下图B：免疫亚型C3(n=23)与免疫亚型C4(n=49)的OS和PFI。
下图C：LSP和C3患者（n=16）与其他组合（LSP C2、C4、C5和C6，或HSP C1、C3、C4和C5；总共n=62）的OS和PFI。
小结：
在本项研究中，作者对ACC免疫生物标志物进行了全面分析以确定在是否有类固醇干扰的情况下预测有利结果的生物标志物，其中包括免疫逃逸调节因子（编码PD-L1的CD274和编码PD-L2的PDCD1LG2），同时，作者也研究了这些配体是否与ACC中的CD8B表达相关。结果表明：转录组数据分析确认并改进了ACC的两种免疫反应途径（HSP和LSP）的定义。同时，在过表达的免疫治疗靶点中，作者证明LSP富含PDCD1LG2(PD-L2)，HSP和LSP都过表达CD276(B7-H3)，这与抗PD1治疗的耐药性有关。总之，作者论证了ACC免疫生物标志物的确定需考虑类固醇因素，否则将对ACC免疫特性的分析产生混淆结果。同时LSP和HSP对ACC患者的鉴定可用于帮助患者是否确定使用免疫治疗。