玩转NGS实验室 | 第十二期：泛生子平台肺癌样本文库构建与测序
高通量测序 (Next Generation Sequencing，NGS) 技术因其通量、成本和效率等各方面的优势，在肿瘤、遗传病及病原微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。随着相关临床研究的持续深入，政策法规的引导与完善，进一步推动了该技术在院内本地化的应用。“玩转NGS实验室”专栏旨在从多角度探讨NGS技术院内本地化应用的相关规范、应用项目及重要进展，推动NGS技术的临床转化。
本文我们将基于泛生子平台讨论肺癌样本的文库构建、文库扩增和基因测序过程。
文库构建
泛生子人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）（国械注准20203400072）（以下简称“肺癌8基因试剂盒”）是构建文库的试剂盒，包含定向扩增非小细胞肺癌（NSCLC）致癌相关基因热点突变区域的两种引物组合：扩增特定区域的引物和携带样本标签的引物。通过将各引物按特定比例混合后进行一次PCR扩增反应，最终将靶向的区域以及相应标签整合到构建好的文库中，再经过一次文库纯化就得到用于上机测序的文库。
人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）
（国械注准20203400072）
本试剂盒采用“一步法”专利扩增建库技术（中国发明专利ZL201710218529.4）（以下简称“一步法”），此技术是集“多、快、稳、省”于一体的高通量测序文库制备技术，具有应用多、速度快、性能稳、成本省等特点。
“一步法”技术把建库流程从传统冗长的多个步骤浓缩到一管试剂中的一步化学反应。把建库时间从传统的1-2天缩短到仅1.5小时（其中人工操作仅需15分钟）。并且相较于传统建库此技术对样本需求量大大降低。该技术的应用可使从收到肺癌样本至出具检测报告最快2个自然日。
泛生子“一步法”技术与其余方法的步骤及用时对比
“一步法”技术操作的简化及时间的缩短有效地避免了文库构建过程中的多种污染问题并提高了检测效率，检测结果的快速出具可帮助临床医生迅速做出诊断，及时制定后续治疗方案，为肿瘤患者争取到极其宝贵的治疗时间。同时适配基因测序仪GENETRON S5（国械注准20193220820）（以下简称“GENETRON S5测序仪”）为中国医院自主开展高通量测序检测提供有力支撑。
文库扩增
乳液PCR
又称为油包水PCR，即文库通过油包水PCR变成可用于上机测序的微珠的过程。
油包水PCR包括两个相：油相和水相。水相是核心，油相包裹在水相外起到分隔作用。水相中包含多种PCR反应的成分：文库、引物、酶、测序微珠、加入dNTP的缓冲液。
测序微珠体积较小，是测序的核心载体，其表面共价连接有众多PCR引物，可与文库的一端互补配对。每一个油包水PCR结构中含有0-N个测序微珠、0-N个文库分子和过量的引物、酶、dNTP。
乳液PCR示意图
当一个油包水PCR结构中同时有文库分子和微珠时，就会发生PCR反应；如果缺少任何一个则不会发生PCR反应。当一个油包水PCR结构中同时有一种文库分子和微珠时，经过PCR扩增反应微珠表面会产生大量PCR产物，均为单克隆片段。由于其与微珠共价键相连，所以在冲洗时可以稳定的保留在微珠上，成为后续测序的模板。[1]
微珠富集
因为PCR引物的5＇端用生物素进行了标记，在乳液PCR结束后，通过链霉亲和素化的磁珠与PCR的微珠混合，两者由生物素-链霉亲和素相结合后，再经过磁铁吸附，将有PCR扩增的微珠富集，而没有PCR扩增的微珠则不被吸附。随后经过专门的洗脱液将富集的微珠收集起来，加入半导体芯片中，进入后续测序步骤。[1]
基因测序
GENETRON S5测序仪的测序芯片是一个表面布满微孔的半导体芯片，每个微孔正好可容纳一个测序微珠，数目高达千万至上亿个。其中每个小孔既是测序微珠的容器，又同时是一个微型的pH计。
测序过程中，测序芯片表面分次通过4种dNTP，微珠表面的PCR分子边合成边进行测序，当一个dNTP结合到DNA链上时，可释放一个焦磷酸和一个氢离子，引起微孔的pH发生变化，被传感器捕获到信号，从而转变为碱基信息。如果DNA链含有两个连续相同的碱基，则捕获到的信号是双倍的。
碱基掺入释放H+转换为电信号捕获
半导体芯片每个微孔相当于一个pH计，捕捉pH变化信号
在测序最前列有4个固定碱基的核心序列，A、C、G、T，测序前先利用核心序列确定每个微孔的信号强度基线，随后的测序得到的信号再与这4个基线对比，从而确定每次有几个碱基进行结合或微孔中的微珠是否为单克隆微珠。
因为测序过程无需扫描和荧光激发等环节，利用半导体传感器内PH变化来判断核酸类型，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间[2-3]。