你是我的眼：NMR在结构解析中的应用策略
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2017年，加拿大魁北克大学Steven R. LaPlante教授在Bioorg. Med. Chem. Lett.发表了题为“NMR strategies to supportmedicinal chemistry workflows for primary structure determination”的文章，详述了各种NMR技术在有机化合物结构解析中的应用策略，包括区分区域异构体和几何异构体，区分N-烷基类似物和O-烷基类似物，鉴定旋转异构体和阻转异构体。
作者开篇先列举了两个药物研发领域中结构表征错误的例子：
第一个是Bosutinib的案例。2012年，C&EN发出警告Bosutinib错误的异构体（下图1a）正在市面出售，而该异构体是没有活性的。购买了该化合物的科学家可能实际上收到的不是真正的分子。当时，Bosutinib正处于治疗慢性粒细胞白血病的III期临床试验中，同时也作为一种酪氨酸激酶抑制剂用于医学和基础研究。据Bosutinib供应商透露，销售错误异构体的公司高达80%，当时，用SciFinder搜索bosutinib可产生300多个结果，可以说，全世界的研究工作可能因此而无效。以牛津大学为例，研究人员从购买的假Bosutinib的日期表明，至少从2006年以来，这种不正确的异构体一直在商业中使用，直到6年后才发现。最终调查结果是合成中使用了错误的苯胺原料，3,5-二氯-4-甲氧基苯胺（1c）代替了正确的2,4-二氯-5-甲氧基苯胺（1d）。C&EN指出，这两个化合物的质谱和元素分析是完全一样的，虽然两个化合物氢谱的芳环信号有所差异，但是如果不将这两个化合物对比分析很难发现问题。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
第二个例子则是关于诱导肿瘤细胞凋亡的化合物TIC10。这个化合物于1973年和2013年被两个不同的公司申请了专利。随后当Scripps研究所人员在研究这个化合物时发现他们制备的化合物居然没有活性，而从国家癌症研究所（NCI）库中获得的TIC10给出了预期的阳性结果。经过仔细分析后发现，被两个公司先后申请专利的化合物2a没有活性，有活性的化合物是其异构体2b。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
咱们接下来就按照原文作者的思路学习一下什么情况下该用什么NMR实验鉴定结构。
区域异构（Regioisomerism）
区域异构产物仅通过LC-MS和/或1H-NMR 是很难区分的，而利用HMQC（HSQC）和HMBC可清楚地表征。在化合物3a中，酯部分位于原子2的间位。在HMBC光谱中，观察到H2/C1与原子2的具有唯一低场相关性。未观察到H2/C3交叉峰。这与化合物3a的结构一致。对于化合物3b，酯部分与C2 邻位，并且在HMBC光谱中观察到原子2的两个低场交叉峰（H2/C1和H2/C3）。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
与所有实验方法一样，HMBC实验也有缺点。贯穿键的耦合常数会发生很大变化，从而很难区分 3JH,C和 2JH,C。 3JH,C耦合常数除其他因素外，还取决于二面角，并且当二面角接近90°时，显然不存在交叉峰。因此，在全面分析中必须考虑不存在峰。
另外，作者认为2D-NMR实验中的ROESY实验对于阐明结构很有价值，因为它可以提供了分子内空间距离在5埃之内的氢原子信息。区域异构体4a和4b的区别仅在于它们在氮杂苯并咪唑基部分上的连接点。从1H和ROESY NMR数据观察，一个可以识别的H2/H1和H2/H6相关性，与化合物一致4a。另一个可以识别H4/H1和H4/H6交叉峰，与化合物4b的结构一致。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
几何异构（Geometric Isomerism）
几何异构体（E/Z）常见于含双键化合物当中。通过耦合常数即可判别，顺式耦合常数通常在3–13Hz和反式在12–20 Hz 。当双键上的氢原子和其他原子存在耦合时会导致出现共振多重峰，这时需要共振去耦，蓝色图谱是选择性去耦之后的氢谱。对于化合物5a，顺式异构体的1 H NMR光谱显示H2与H1质子和H3耦合而成为多重峰。另一方面，H3被与H5的重叠所遮盖。由于这一障碍，无法确定3JH3,H2，但是，通过有选择地将H1解耦（右），质子H2简化为一个双峰，从中可以导出与H3的耦合（3JH3,H2 = 9.8 Hz），与顺式异构体一致。对于化合物5b，H3与H4偶联。去耦后，从中可以提取出与H2的大耦合，3JH3,H= 15.2 Hz，与反式异构体一致。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
旋转异构/阻转异构（Rotamers/Atropisomers）
旋转异构是由于化合物受空间因素，电子效应，氢键等因素沿单键旋转受限或环翻转受阻而产生的。如果旋转/翻转的障碍大于20 kcal / mol，则会产生手性，从而形成阻转异构体。小于20 kcal /mol会导致旋转异构体（共聚体）出现。旋转异构体无法通过LC方法分离。遇到这种情况，作者提供了常见的解决办法：变温（VT）以及ROESY。作者以三级酰胺的NMR变温实验和ROESY实验为例介绍了这种旋转异构体的NMR信号特点。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
N-烷基化和O-烷基化（N- vs. O-Alkylation）
烷基化反应通常导致不可预测的O-和N- 烷基类似物。采用13 C化学位移可区分由环境性配体形成的N-与O-烷基化产物。如下图，在N-烷基化类似物中，13 C位移下降至46.8ppm， 而在O-类似物中，信号出现在68.9ppm处 。
立体化学异构体（Stereoisomerism）
确定手性分子的绝对构型最简便的就是X射线衍射。另一方面，ROESY也是确定手性化合物立体化学的非常实用的方法。对于化合物9观察到脯氨酸环平面上方的氢原子彼此之间具有强的ROESY峰，而与脯氨酸平面下方的氢原子相比具有较弱的峰。交叉峰2/3的尺寸小于2'/3的尺寸。观察到了尖峰1/2'和2/4，但没有观察到1/2和2'/ 4。5/5'是重叠的，不能用作距离比较，但是2和2'很好地分离了。该数据证实立体化学如图9 所示。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
文末，作者总结了一个超级实用的表格告诉大家什么情况应该用哪种NMR技术。
图片来源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
绝对的实用干货，适用于大多数有机合成初学者，同学们可以多多转发，拯救更多被NMR困扰的小伙伴们。我们更欢迎各位整日以鉴定结构为业的植化/天然药化大牛们也来分享自己的宝贵经验。